천연 생약에서 추출한 지표성분들의 모발 성장에 미치는 영향

본 연구에서는 한국물질은행에서 천연 생약 추출물을 분리, 정제한 지표 성분을 분양 받아 사용하였다(Table 1). 인간 모낭진피유두세포(hHDPC: human hair follicle dermal papilla cells., Abm Inc; Richmond, BC, Canada)는 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin., Gibco™, Thermo fisher scientific, Waltham, MA, USA)100 U/mL 의 농도로 사용하였고 10% 태아 소혈청(fetal bovine serum; FBS., HyClone™, Marlborough, MA, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM., Corning, NY, USA), 배지로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 유지하였다. Wnt 리포터 NIH3T3 세포 주는 Wnt 표적 유전자 발현을 활성화하기 위한 TCF/LEF luciferase 전사 인자에 대해 Enzo life science(Farmingdale, NY, USA)로부터 입수하였다. HEK293 세포 주에서 발현하는 안정한 HEK-Blue-STAT6 전사 인자의 SEAP Luciferase 리포터 유전자는 Novus (Littleton, CO, USA)에서 구입하였다. TCF/LEF와 SEAP 리포터 세포는 제품 설명서에 따라 배양하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 유지했다.

인간 모낭진피유두세포 증식은 CellTiter-Glo^® luminescent cell viability assay kit (Promega, Madison, WI, USA)는 대사 활성 세포의 존재를 나타내는 ATP의 정량을 기반으로 배양액에서 생존 세포의 수를 결정하는 방법이다. 간략히 설명하면, 세포를 96 well plate에 1×10⁴ cell/well 넣은 후 24시간 배양 후 천연물 지표 성분들 10 μM 농도로 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 결과를 확인하기 위해 각 well에 존재하는 세포 배양 배지의 부피와 동일한 부피의 CellTiter-Glo^® reagent를 첨가하고 실온에서 10분 동안 반응한 후 발광되는 ATP의 양을 LuBi microplate luminometer (Berthold TEC GmbH & Co., Oakridge, TN, USA)에서 측정하였다. 실시간 살아 움직이는 세포의 성장(Real time live cell imaging)을 관찰하기 위해 JuLI^TM FL (NanoEntek, Guro-gu, Seoul, Korea)을 사용하여 세포 성장을 관찰 기록하였다. 모든 실험은 3번 이상 반복하였고, 평균값은 표준편차와 함께 표시하였다.

인간 모낭진피유두세포(5×10⁵ cells/well)를 6-well plates에 접종하였고, 천연물 지표 성분 10 μM 처리하여 72시간 동안 배양시켰다. 그 후, aurum total RNA mini kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 1 μg의 총 RNA를 이용하여 moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (MMLV-RTase) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 첫번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 GeneAmp PCR 9700 thermocycler (Thermo fisher scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 분자 표적 primer와 반응시켰다. 정량적 유전자 발현 수준은 CFX96 Touch PCR system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)상에서 SYBR Green reagents(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 측정하였다. 상대적 표적 유전자 발현은 GAPDH 수준으로 표준화한 후에 측정하였다. 각각의 실험에 있어서, 2번의 독립적인 실험을 3번 반복하여 결과를 계산하였다. RT-PCR을 위한 primer 디자인은 Table 2와 같다.

Wnt/β-catenin 신호전달을 보기 위해 TCF/LEF luciferase 구조체로 형질 감염된 NIH3T3세포와 JAK3-STAT6 신호전달의 secreted alkaline phosphatase (SEAP)–luciferase로 형질 감염된 HEK293세포를 이용하였으며 세포는 96-well plate (3×10³ cells/well)에 접종하였고, 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 24시간 동안 유지하였다. 그 후, TCF/LEF luciferase는 양성대조군으로 Wnt 3a (50%, v/v) 또는 생약지표성분을 처리하였고 SEAP-luciferase로 형질 감염된 HEK293세포는 IL-4 (10 ng/mL)와 생약지표성분을 혼합하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다. 측정은 phospha-light system을 이용하여 세포 용해 후 luciferase 활성을 LuBi luminometer (Berthold TEC GmbH & Co., Oakridge, TN, USA)를 통해 측정하였다. 모든 실험은 적어도 3번 이상 반복하였고, 평균값은 표준편차와 함께 표시하였다.

실험결과는 SPSS subscription (IBM SPSS Statistics, USA)를 이용하여 통계적 유의성을 평가하였다. 정규성은 shapiro-wilk test를 통해 검정하였으며, 정규성을 만족하면 모수 검정, 정규성을 만족하지 않으면 비모수 검정을 실시하였다. 통계분석 결과는 95% 신뢰구간에서 유의성 여부를 확인하였다. 전후 비교는 모수검증으로 paired t-test를 실시하였고, 비모수 검정으로 wilcoxon signed-rank test를 이용하였다.

본 연구에서는 천연 생약 지표성분들이 인간 모낭진피유두세포의 성장에 미치는 영향을 조사하였다. 양성대조군으로 minoxidil (0.4 μM)과 tofacitinib(0.4 μM)을 사용하였다. xCELLigence 시스템을 사용하여 실시간 세포 증식의 분석과 대사 활성 세포의 존재를 나타내는 ATP (CellTiter-Glo^® luminescent lell viability assay kit)의 정량을 기반으로 배양액에서 생존 세포의 수를 결정한 결과를 기반으로 인간 모낭진피유두세포의 성장이 음성 대조군 대비 유의적 효과를 보이는 10종의 지표 성분(decursin, honokiol, costunolide, 3-deoxysappanchalcone, acetylshikonin, isoalantolactone, 2,2'-dihydroxy-4',6'-dimethoxychalcone, vitexicarpin, broussochalcone A, 3-deoxysappanone B)과 양성대조군 minoxidil 대비 동등 그리고 이상은 7종(honokiol, costunolide, 3-deoxysappanchalcone, acetylshikonin, isoalantolactone, broussochalcone A, 3-deoxysappanone B)이 있음을 확인하였다(Fig. 1). 모낭 진피유두세포 성장을 유도하는 생약 지표 성분 중 양성 대조군 대비 동등 또는 그 이상의 세포 성장을 보이는 7종을 선택하여 세포를 접종한 후 7종의 지표 성분을 처리하여 실시간 살아 움직이는 세포를 관찰하여 72시간에 세포 성장 형태를 관찰 기록하였다. 그 결과 양성 대조군인 minoxidil과 tofacitinib은 성장이 촉진됨을 관찰할 수 있었으며 honokiol, costunolide, 3-deoxysappanchalcone, isoalantolactone 성분도 양성 대조군 동등 수준으로 성장함을 관찰하였다(Fig. 2).

Fig. 1. Effects of natural herbal marker compounds on hHDFP cell growth. To evaluate the effect of 32 natural herbal marker compounds on hHDFP cell growth using CellTiter-Glo® luminescent cell growth assay as described in the methods. 1 x 10³ cell/50μL was inoculated into 96-well plate, treated with natural herbal marker compounds (10 μM) and cultured for 72 h. minoxidil (0.4 μM) and tofacitinib (0.4 μM) was used as a positive control. Each assay is representative for 3 experiments. The asterisk indicates a significant statistical significance (^**p<0.05).

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Fig. 2. Cell proliferation and live cell images at 0 and 72 h after treatment of hHDFP cells with natural herbal marker compounds.

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세포의 성장을 유도하는 천연 생약 추출물 지표 성분 7종에 대한 모발 성장 조절 인자에 미치는 영향을 알아보기 위해 기존의 정량적 역전사 효소 PCR (RT-PCR)을 사용하여 다양한 유전자의 전사 발현 변화를 분석했다. 그 결과 7종 지표성분에서 Wnt/β-catenin 신호전달 체계의 주요 조절 유전자인 β-catenin, TCF/LEF의 발현이 음성과 양성 대조군 대비 증가함을 알 수가 있고 특히 isoalantolacton의 발현이 높음을 알 수가 있다(Fig. 3A). 양성대조군인 minoxidil (Huang and Senna, 2022)과 tofactinib (Ramot and Zlotogorski, 2020)는 이미 많은 연구결과에서 알 수 있듯이 Wnt/β-catenin 신호전달체계에는 영향이 없음을 알 수가 있다. 현재 Wnt/β-catenin을 조절하는 소재 개발을 위해 많이 연구 중에 있다(Jung et al., 2022; Liu et al., 2022). 다음으로 JAK family의 STATs 활성을 평가하였다. 염증성 사이토카인(cytokines)들에 의해 유도되는 JAKs-STATs 경로는 다양한 전 염증 신호를 전달하는 경로로 조혈 및 면역기능을 담당한다. JAK kinase들의 substrate로는 7가지의 STATs(STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6)와 구조를 이루고 있다(Damsky and King, 2017; Paus et al., 2018). 모낭 세포의 세포성장, 증식, 생존 억제와 관련되어 있는 STAT 1, 4, 5 그리고 6의 유전자 발현을 평가하였다. 양성대조군으로는 류마티스 관절염 치료제로 개발되었으나 모발을 빠르게 성장시키도록 촉진하는 JAK 1, 3 억제제인 tofacitinib (Harel et al., 2015; Liu et al., 2017)로 비교하였다. 그 결과 7종의 생약 지표 성분은 tofacitinib 보다 억제율이 동등 또는 그 이상의 억제율을 관찰할 수 없었으나 3-deoxysappanchalcone에서 STATs의 mRNA유전자 발현이 억제됨을 알 수가 있었다(Fig. 3B). 인간 모낭진피유두세포의 성장 주기와 사멸을 조절하는 cycline dependent kinase 4 (CDK4)와 Bcl-2, Bax에서는 성장 주기의 G1 단계에서 honokiol, costunolide, 3-deoxysappanchalcone, acetylshikonin, isoalantolactone는 minoxidil대비 동등 또는 이상의 CDK4 유전자 발현이 증가함을 알 수가 있었다. Tofacitinib은 인간 모낭진피유두세포에서 유사한 패턴의 유전자 발현 변화를 관찰할 수 있었다 (Fig. 3C).

Fig. 3. Gene expression. mRNA expression effects on hHDFP cells by natural herbal compounds. The gene expression of hair growth regulating factors was detected by real-time qPCR using primers in HDPCs. (A) β-catenin, TCF/LEF and GSK-3β primers, (B) STAT1, STAT4,STAT5A and STAT6. (C) BAX, BCL-2 and CDK4. Each assay is representative for 3 experiments. The asterisk indicates a significant statistical significance (^**p<0.05).

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탈모증의 페러다임 변화를 가져올 수 있는 새로운 탈모 조절 표적 단백질은 Wnt/β-catenin 그리고 JAKs-STAT 경로를 조절하는 의약품 또는 기능성 소재에 초점을 맞추고 있다(Choi, 2020; Harel et al., 2015; Liu et al., 2017; Ryu et al., 2021). Wnt/β-catenin은 현재 개발된 의약품이나 기능성 소재는 없고 연구 개발 진행 중이며 이외의 류마티스 관절염 치료제인 tofacitinib의 경우는 야누스 인산화 효소(janus kinase)를 억제함으로써 다양한 염증 세포를 동시에 차단하는 약물로 탈모증 치료제 개발이 활발이 진행 중이다(Sanchez-Diaz et al., 2022). 본 연구에서는 NIH3T3-Wnt-luciferase 세포를 사용하여 TCF/LEF reporter 유전자 전사 활성에 대한 생약 지표성분들의 효과를 평가했다(Fig. 4A). 그 결과, honokiol, costunolide, 3-deoxysappanchalcone, isoalantolactone는 β-catenin 인산화 억제를 통해 β-catenin을 안정화시켜 TCF/LEF 활성화를 일으키는 것을 관찰했다. IL-4에 의한 JAK3-STAT6 신호전달 체계에서 SEAP reporter 유전자 전사 활성에 대한 생약 지표성분들의 효과를 확인하기 위해 SEAP luciferase reporter plasmid를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에 생약 지표성분들을 처리하여 STAT6 매개 luciferase 활성을 측정했다. 그 결과, 3-deoxysappanchalcone, 3-deoxysappanone B는 IL-4에 의한 JAK1/3 활성화로 STAT6 인산화가 억제됨을 알 수가 있었다(Fig. 4B). 효과를 보이는 생약지표성분이 진피 모낭 유두 세포의 분자 표적인 Wnt와 JAK1/3 신호전달 체계를 통해 모발의 성장을 조절함을 알 수가 있었다. 본 연구 결과를 기반으로 32종의 천연 생약 추출물의 지표 성분이 진피모낭유두세포 성장에 미치는 영향을 형태학적인 성장과 대표적인 표적 분자 유전자 조절에 대해 조사하였으며 그 중 costunolide (Kim et al., 2019), 3-deoxysappanchalcone (Kim et al., 2016) 두 성분에 대해선 앞선 분자 기전 연구를 실시하여 증명하였으며 두 성분의 결과와 비교하여 신규 가능성 있는 지표성분들의 실험 평가의 신뢰도를 높일 수 있었다. 천연물 생약 추출물로부터 탈모 조절 효능을 가지는 honokiol, isoalantolactone, broussochalcone A, 3-deoxysappanone B 성분에 대한 새로운 탈모 조절 단백질의 작용 메커니즘을 입증함으로써 현실적인 탈모 개선 제품의 개발 가능성을 제시하고자 한다.

Fig. 4. Effects of natural herbal marker compounds on reporter gene assay. To evaluate the effect of 7 natural herbal marker compounds on TCF/LEF, which plays an important role in hair growth, Wnt-3T3 cells transfected with the TCF/LEF luciferase construct were inoculated at 3x10³ cell/ 50μL or HEK293 cells permanently transfected with IL-4R site-TKluc/STAT 6 contained IL-4 receptor site were inoculated at 1×10⁴ cell/ 50μL in each well of a 96-well plate in DMEM containing 5% FBS for 24 h. The activity of luciferase was measured after 48 h treatment with natural herbal marker compounds (10 μM). (A) TCF/LEF reporter gene activity, Wnt3a 50% was used as a positive control. (B) IL-4 induced STAT 6 reporter gene activity. Each assay is representative for 3 experiments. The asterisk(s) indicate a significant statistical significance (^**p < 0.05).

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