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서 론
자몽은 다른 감귤류와 마찬가지로 구연산과 같은 유기산이 풍부하며(Ivanova et al., 2018), naringin, neohesperedin 같은 플라보노이드와 gallic acid, chlorogenic acid, caffeic acid 및 ferulic acid 등 항산화 물질이 다량 함유되어 있다(Xi et al., 2015). 자몽의 pH는 약 3.0으로 비교적 낮고(Juven, 1976), 플라보노이드와 gallic acid, chlorogenic acid 등 phytochemicals가 풍부하여 일반적인 미생물들이 생장하기 어렵다.
덱스트란(dextran)은 복잡한 분지형 글루칸이며, C-1 → C-6의 당결합 효소인 dextransucrase를 가지고 있는 미생물에서 유래된 poly-α-d-glucoside이다(Du et al., 2020; Moss et al., 1995). Leuconostoc mesenteroides 균주가 생산하는 덱스트란은 비피도박테리아와 같은 장내 유익균과 상호작용하여 성장을 촉진한다(Kim et al., 2022). 또한 장내 미생물 균총에 의한 덱스트란의 이용은 장내 pH를 낮추는 단쇄지방산(short chain fatty acid, SCFA)을 생성하며, 이는 장내 병원성 세균의 성장을 억제하여 장내 유익균을 활성화시킨다(Kim et al., 2022; Kothari et al., 2015; Mussatto et al., 2007).
본 연구에서는 항산화 활성 등 기능성이 우수한 자몽추출물에 선행연구를 통하여 분리한 Leu. mesenteroides CJNU 0147 균주를 적용하여 덱스트란 생산 조건을 확립하였으며 발효 자몽추출물의 장내 유해세균 억제 및 유익균 증식능을 검증하였다.
재료 및 방법
Leu. mesenteroides CJNU 0147 균주는 선행연구를 통하여 분리하였고(Eom and Moon, 2010) 덱스트란 생산을 위한 발효 자몽추출물 제조에 사용하였다. 장내 유해세균 억제능 평가를 위해서 사용한 Clostridium difficile KCTC 5009 균주는 한국생명공학연구원 산하 생물자원센터(정읍시 소재)에서 분양받아 사용하였다. 비피도박테리아 증식능 확인을 위한 균주로는 Bifidobacterium breve KCTC 3220 균주(생물자원센터 분양)를 사용하였다. 유산균용 배양 배지는 MRS 배지(BD, Sparks, MD, USA)를 사용하였고 B. breve 균주와 C. difficile 균주는 RCM 배지(BD)를 이용하여 혐기챔버(DG250; Don Whitley Scientific Ltd., Bingley, UK)에서 배양하였다.
레드자몽농축액(63brix, HCS-4056, 이스라엘)을 (주)내츄럴코어(전북 고창 소재)로부터 제공받아 1차 증류수로 희석하고 sodium carbonate solution(33.3%)을 사용하여 pH 5.0으로 조정하였다. 액체배지(10 brix)는 sucrose 2%, 고체배지(10, 20 brix)는 sucrose 2%와 agar 1.5%를 첨가한 후 80℃, 30 min으로 살균하여 자몽추출물 배지로 사용하였다.
제조된 자몽추출물 고체배지(10, 20 brix)에 Leu. mesenteroides CJNU 0147 균주 배양액을 2 μL 점적한 후 25℃, 24 h 배양하여 콜로니 상에 점질물이 형성되는지 유무로 덱스트란 생성 여부를 확인하였다.
자몽추출물 액체배지(10 brix, pH 5.0) 5 mL에 Leu. mesenteroides CJNU 0147 균주 배양액을 1% 접종한 후 25℃, 12 h 조건으로 배양하였다. 발효 자몽추출물을 80℃, 30 min 살균처리한 후 MRS agar plate에 도말하여 생균 유무를 확인하였다. 발효 자몽추출물의 장내 유해세균에 대한 생육 억제능을 확인하기 위하여 C. difficile KCTC 5009 균주를 사용하였다. C. difficile KCTC 5009 균주를 최적배지인 RCM broth 5 mL에 접종한 후 대조군(비 발효 자몽추출물)과 함께 발효 자몽추출물을 최종농도 0.5 brix와 1 brix로 첨가하였다. 이후 37℃에서 혐기배양하면서 경시적으로(0, 6, 12 h) 생균수를 측정하여 C. difficile KCTC 5009 균주의 생육 억제 유무를 판단하였다.
결과 및 고찰
자몽추출물 고체배지(10, 20 brix)에 Leu. mesenteroides CJNU 0147 균주 배양액 2 μL를 점적한 후 25℃에서 24 h 동안 배양했을 때, 자몽추출물 10 brix 배지의 경우 12 h 이후에 점질물(덱스트란)이 생성되었고(Fig. 1A), 20 brix 배지는 24 h 이후에 점질물이 생성되었다(Fig. 1B). 이는 20 brix 배지에서 Leu. mesenteroides CJNU 0147 균주의 생육속도가 상대적으로 느려 점질물의 생성이 지연된 것으로 추론되었다. 본 연구에서 제조된 자몽추출물 배지는 다른 영양성분의 첨가없이 덱스트란 생성에 필요한 sucrose만 첨가하여 산업적인 측면에서 경제적이다. Leu. mesenteroides 균종은 dextransucrase(a glucosyltransferase; E. C. 2.4.1.5)라는 효소를 가지고 있어 sucrose(β-D-fructofuranosyl α-D-glucopyranoside)의 glucose 분자를 이용하여 덱스트란을 합성하고, fructose를 유리시킨다(Dols et al., 1998). Leu. mesenteroides CJNU 0147 균주 역시 sucrose를 이용하여 덱스트란을 생성하는 것으로 확인되었다. 생성된 덱스트란의 분자량 및 구조는 추가연구를 통하여 분석할 예정이다.
발효 자몽추출물의 장내 유해세균 생육 억제능을 확인하기 위하여 C. difficile KCTC 5009 균주를 사용하였다. 최종농도 0.5 brix에서 자몽추출물(대조군)의 경우, C. difficile KCTC 5009 균주의 생균수가 무첨가군에 비해 거의 감소하지 않은 반면, 발효 자몽추출물은 12 h에 무첨가군 대비 0.78 log CFU/mL로 통계적으로 유의하게(p<0.05) 감소하였다(Fig. 2A). 최종농도 1.0 brix에서 자몽추출물(대조군)은 C. difficile KCTC 5009 균주가 12 h에 무첨가군 대비 0.49 log CFU/mL(p<0.05)로 감소하였고, 발효 자몽추출물은 12 h에 무첨가군 대비 1.25 log CFU/mL(p<0.001)로 감소하여 대조군보다 발효 자몽추출물이 C. difficile KCTC 5009 균주에 대한 억제능이 더 우수하였다(Fig. 2B). 이는 Leu. mesenteroides CJNU 0147 균주를 적용한 자몽추출물의 발효과정에서 유기산을 포함한 C. difficile 생육 억제 대사산물들이 생산되었음을 의미한다.
자몽추출물(대조군)과 Leu. mesenteroides CJNU 0147 균주 적용 발효 자몽추출물의 B. breve KCTC 3220 균주에 대한 증식능을 비교하였다. RCM broth 5 mL에 대조군 및 발효 자몽추출물의 최종농도가 0.5 brix, 1 brix 되도록 첨가한 후 12 h 배양하여 B. breve KCTC 3220 균주의 생균수를 비교한 결과, 무첨가군의 경우 5.60 log CFU/mL에서 시작하여 6, 12 h에 각각 7.16, 7.86 log CFU/mL 증가하였고, 최종농도 0.5 brix가 되도록 첨가한 대조군은 5.67 log CFU/mL로 시작하여 6, 12 h에 각각 7.31, 8.65 log CFU/mL로 증가하였다. 반면, 최종농도 0.5 brix가 되도록 첨가한 발효 자몽추출물은 5.79 log CFU/mL로 시작하여 6, 12 h에 각각 7.64, 9.15 log CFU/mL로 증가하여 12 h 기준 무첨가군 대비 1.29 log CFU/mL, 대조군 대비 0.50 log CFU/mL의 생균수 차이를 보였다(Fig. 3A). 시료의 최종농도를 1 brix로 첨가한 실험에서도 비슷한 경향이 관찰되었다(Fig. 3B). 이러한 결과는 자몽추출물 자체도 비피도박테리아 증식능을 가지고 있음을 의미하며 Leu. mesenteroides CJNU 0147 균주를 적용할 경우 증식능이 더 향상됨을 의미한다. 즉, 자몽추출물의 발효 과정에서 덱스트란을 비롯한 비피도박테리아 증식인자가 생산되었음을 추론할 수 있다. 서론에서 언급한 바와 같이 덱스트란은 비피도박테리아의 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 선행연구에서 Leu. mesenteroides CJNU 0147 균주와 Lactobacillus casei CJNU 0588 균주를 동시에 접종하여 생산한 유청발효물의 비피도박테리아(Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum) 증식능이 확인된 바 있다(Kim et al., 2022; Lee et al., 2011; Moon, 2013). 이러한 결과들을 종합해 볼 때 자몽추출물의 발효과정에서 생산되는 미생물 대사산물과 생물전환물이 복합적으로 비피도박테리아 증식능에 관여하였을 것으로 판단된다. 다만, 보다 정밀한 분석이 이루어지기 위해서는 발효 전 · 후 대사체 분석을 통하여 해석하는 것이 합리적일 것이다.
요 약
기능성 물질이 풍부한 자몽추출물의 pH를 5.0으로 조정하고 sucrose (최종농도, 2%)를 첨가한 후 Leu. mesenteroides CJNU 0147 균주를 적용하여 덱스트란이 함유된 발효 자몽추출물을 제조하였다. 제조된 발효 자몽추출물을 이용하여 장내 유해세균인 C. difficile 균주에 대한 생육저해 효과를 분석한 결과, 생균수가 유의적으로 감소하였다(0.5 brix, p<0.05 vs. control; 1.0 brix, p<0.001 vs. control). 반면, 인체 유익균으로 잘 알려진 비피도박테리움 속 균종 중에 하나인 B. breve 균주에 대해서는 증식능(0.5 brix, 1.0 brix, p<0.001 vs. control)이 우수하였다. 이러한 결과는 Leu. mesenteroides CJNU 0147 균주 적용 발효 자몽추출물이 장내 유해세균의 성장을 억제하면서 동시에 유익균인 비피도박테리아의 증식을 촉진하는 것을 의미하며 향후 장내 건강기능성 소재로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
