Curr. Top. Lact. Acid Bact. Probiotics 2021; 7(2):77-81

pISSN: 2287-853X

DOI: https://doi.org/10.35732/ctlabp.2021.7.2.77

Research Article

Kefir 유래 유산균 Lactiplantibacillus pentosus Strains의 다제내성균에 대한 항균효과

이정은1https://orcid.org/0000-0002-7442-7045, 김진홍2https://orcid.org/0000-0002-2763-3163, 국무창3,*https://orcid.org/0000-0003-4098-8298
Antimicrobial Effect of Lactiplantibacillus pentosus Strains Isolated from Kefir against Multidrug-Resistant Bacteria
Jeong-Eun Lee1https://orcid.org/0000-0002-7442-7045, Jin-Hong Kim2https://orcid.org/0000-0002-2763-3163, Moochang Kook3,*https://orcid.org/0000-0003-4098-8298
Author Information & Copyright ▼
1경기대학교 대학원 대체의학과
2(주)더가든오브내추럴솔루션
3배화여자대학교 식품영양학과
1Department of Alternative Medicine, Kyonggi University, Seoul 03746, Republic of Korea
2The Garden of Natural Solution, Gyeonggi-do 18103, Republic of Korea
3Department of Food & Nutrition, Baewha Women's University, Seoul 03039, Republic of Korea
*Corresponding author : Moochang Kook, Department of Food & Nutrition, Baewha Women's University, Seoul 03039, Republic of Korea, Tel: +82-2-399-0765, Fax: +82-2-737-6711, E-mail: bmse153@gmail.com

Copyright © Korean Society for Lactic Acid Bacteria and Probiotics. This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Received: Dec 06, 2021; Revised: Dec 23, 2021; Accepted: Dec 27, 2021

Published Online: Dec 31, 2021

Abstract

In this study, the inhibitory effect of Lactiplantibacillus pentosus BMSE-K006 and K009 against multidrug-resistant strains, such as Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Escherichia spp., Pseudomonas spp., Salmonella spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., was to be confirmed. The antimicrobial effect of L. pentosus BMSE-K006 was confirmed higher than L. pentosus BMSE-K009, except for Escherichia coli 1507 CCARM 0236. This study can verify the remarkable antimicrobial effect of LAB isolated from kefir against multidrug-resistant strains, and it is considered that additional studies on the characteristics and safety of probiotics are needed.

Keywords: kefir; lactic acid bacteria; antimicrobial effect

서 론

Kefir는 여러 종의 박테리아와 효모가 존재하는 kefir grain을 발효하여 얻어지는 acidic-alcoholic 발효유이다(Leite et al., 2013; Prado et al., 2015). Kefir grain에는 108 cfu/g의 lactic acid bacteria(LAB), 105 cfu/g의 acetic acid bacteria 및 106-107 cfu/g의 효모가 존재하며, kefir에서 가장 흔히 발견되는 박테리아는 Lactobacillus (Lb) spp., Lactococcus (Lc) spp., Streptococcus spp. 및 Leuconostoc spp. 등이 있다(Garrote et al., 2010; Bourrie et al., 2016). 이처럼 kefir는 안전하고 잠재적으로 유익한 균주의 저장소 역할을 할 뿐만 아니라, 다양한 미생물 구성으로 인해 probiotics 자원으로 간주된다(Prado et al., 2015; Bengoa et al., 2018).

최근 연구된 kefir 유래 유산균으로는 Lc. lactis, Lb. kefiri, Lb. plantarum, Lb. pentosus(Gamba et al., 2002; Wang et al., 2009), Lc. kefiranofaciens(Maeda et al., 2004), Lc. cremoris, Lc. lactis, S. thermophilus, S. durans(Yüksekdağ et al., 2004) 등이 있으며, 그 중 Lactobacillus spp.는 kefir grain의 우세한 종으로 알려져 있다(Slattery et al., 2019). Kefir 내 미생물 조성은 원산지, 발효과정에서 사용되는 기질, 배양조건 및 저장 및 가공 과정 등에 크게 의존하여 달라질 수 있으며(Garrote et al., 2010; Bourrie et al., 2016; Bengoa et al., 2018), kefir의 영양성분 또한 발효 시 사용되는 우유, kefir grain 내 미생물 조성, 발효시간 및 온도, 보관조건에 따라 달라진다(Rosa et al., 2017). Kefir에는 다양한 유산균과 대사산물이 존재하여 콜레스테롤 수치 감소(Vujičić et al., 1992), 항균 및 항진균(Cevikbas et al., 1994), 대장암(Khoury et al., 2014), 피부암(Nagira et al., 2002) 등 광범위한 건강상의 이점을 제공하는 것으로 알려져 있으며(Bourrie et al., 2016), kefir 뿐만 아니라, kefir 유래 유산균 또한 총 콜레스테롤 및 중성지방 감소(Maeda et al., 2004; Wang et al., 2009), 항균 및 항진균(Yüksekdağ et al., 2004), 면역 및 종양세포 억제(Yamane et al., 2018), 항산화, 항알레르기 및 종양억제(Slattery et al., 2019) 등에 대한 효능이 연구된 바 있다. 한편, 최근 항생제의 사용빈도와 농도의 증가 및 무분별한 항생제 사용으로 인한 다제내성(multidrug-resistance, MDR) bacteria가 출현하여 전세계적인 문제로 대두되었다(Moon et al., 2006; Shin, 2017). 이에 본 연구에서는 항생제 내성 균주의 문제를 예방 및 해결하기 위해 선행된 Lee 와 Kook(2021)의 연구에서 분리한 kefir 유래 유산균 Lb. pentosus BMSE-K006과 Lb. pentosus BMSE-K009의 후속 연구로써 다제내성 균에 대한 항균효과를 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

다제내성 균에 대한 항균활성 측정

항균활성 측정에 사용된 지시균주는 다제내성 균주를 포함하여 Staphylococcus spp., Escherichia spp. 등 총 7주로 각 균주와 항생제 정보는 서울여자대학교로부터 제공받아 사용하였다(Table 1). 항균활성 측정에 사용된 지시균주는 각각 Luria-Bertani broth (Difco Co., Sparks, MD, USA), Tryptone Soy Broth(Difco)에 2% (v/v) 접종하여 37℃에서 18시간 배양 후, 배양액과 0.85% NaCl을 1:9 (v/v)수준에서 연속적으로 희석하여 최종 지시균주의 균수를 106 CFU/mL로 조정한 균액을 실험에 사용하였다. 다제내성 균주의 항균활성은 disk diffusion 방법을 사용하여 측정하였으며, clear zone의 크기가 15mm 이상이면 +++, 10-15mm는 ++, 10mm 미만일 경우 +로 판별하였다. 본 연구의 모든 항균활성 측정에는 유산균을 MRS broth에 2% (v/v) 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 5분간 원심분리(13,000 × g) 하여 상등액을 취해 0.2 μm membrane filter(Hyundai micro Co.)로 여과한 것을 시료로 사용하였다.

Table 1. List of indicator strains
Strains Collection no. Culture media Antibiotics resistant1)
Gram+ Staphylococcus aureus KCCM 11335 TSB -
Staphylococcus aureus 285 CCARM 0204 TSB Amp, Nor, GM
Staphylococcus aureus 503 CCARM 0205 TSB Amp, Nor, GM
Gram- Escherichia coli KCTC 2571 LB -
Escherichia coli 078 CCARM 0230 LB Amp, Nor, GM
Escherichia coli DC 0 CCARM 0237 LB Amp, Nor, GM
Escherichia coli 1507 CCARM 0236 LB Amp, Nor, GM

1) AMP; ampicillin, Nor; norfloxacin, GM; gentamycin.

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최소저해농도(Minimum inhibitory concentration, MIC)와 최소살균농도(Minimum bactericidal concentration, MBC) 측정

MIC 및 MBC 측정에는 다제내성 균을 포함하는 그람 양성균 Staphylococcus spp., 그람 음성균 Escherichia spp. 등 7주를 대상으로 측정하였으며, 지시 균주는 각각 TSB 및 LB broth에 2% (v/v) 수준으로 접종하여 37℃에서 18시간 배양 후, 최종 지시균주의 균수를 106 CFU/mL로 조정한 균액을 실험에 사용하였다. MIC 및 MBC는 Wiegand et al.,(2008)의 액체배지 희석법(broth dilution method)을 이용하여 확인하였다. 96-well microplate (cell culture plate, SPL Life Sciences, Korea)에 액체배지와 시료를 첨가하여 2-fold dilution하여 지시 균주를 분주하고, 37℃에서 18시간 배양하여 생육 저해정도를 확인하였다. 이후, TSA, LB agar plate에 획선도말하여 37℃에서 24시간 배양 후, 콜로니 생성이 저해되는 최소농도를 최소저해농도(MIC), 콜로니 생성이 확인되지 않는 농도를 최소살균농도(MBC)로 설정하였다. 농도는 유산균 배양액 내 단백질 함량(mg/mL)으로 표기하였으며, 유산균 배양액의 단백질 정량은 BCA protein assay kit(TakaRa Bio Inc., Japan)를 이용하여 BCA(bicinchoninic acid) protein assay를 시행하였으며, bovine serum albumin(BSA)을 이용하여 정량하였다.

통계분석

본 연구에서는 모든 실험을 3회 이상 반복 수행하였으며, 결과는 SPSS(Statistical Package for the Social Science, Ver. 20, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 통계분석하였다. 각 실험군에 대한 유의적 차이는 독립표본 t-test를 실시하여 p<0.05 수준에서 유의성을 검토하였다.

결과 및 고찰

다제내성 균에 대한 항균활성

유산균은 젖산(lactic acid), 박테리오신(bacteriocin) 및 과산화수소(hydrogen peroxide) 등에 의해 항균효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Mezaini et al., 2009). Lee와 Kook(2021)은 항균효과가 우수한 균주를 선별하기 위해 kefir 유래 유산균 6주의 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항균 효과를 확인하였으며, 그 중 L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE-K009의 우수한 항균효과를 보고하였다. 이에 본 연구에서는 L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE-K009의 후속 연구로서 Staphylococcus spp., Escherichia spp. 등 총 5주의 다제내성 균주에 대한 항균효과를 확인하였다(Table 2).

Table 2. Antimicrobial effects of Lactiplantibacillus pentosus BMSE- K006 and K009 against multidrug-resistant bacteria
Strains K006 K009
Gram+ Staphylococcus aureus 285 CCARM 0204 + +
Staphylococcus aureus 503 CCARM 0205 + +
Gram- Escherichia coli 078 CCARM 0230 w w
Escherichia coli DC 0 CCARM 0237 + +
Escherichia coli 1507 CCARM 0236 + +

1) -; negative, w; weak positive, +; < 10mm.

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그 결과, L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE-K009는 다제내성균 중 그람 음성균 Staphylococcus spp.보다 그람 음성균 Escherichia spp.에서 억제효과가 더 큰 것으로 확인되었다. 본 연구의 disk diffusion 방법에 의한 다제내성 균주에 대한 항균효과는 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에서 다소 낮은 활성을 보였으나, Chifiriuc et al.,(2011)은 Enterococcus spp., Salmonella spp., Staphylococcus spp., Escherichia spp.등에 대한 kefir의 우수한 항균효과와 kefir 내 probiotics에 의한 넓은 항균 스펙트럼을 보고하였다. Abriouel et al.,(2011)이 분리한 L. pentosus MP-10 균주 또한 Salmonella spp.과 S. aureus 및 E. faecalis 에 대한 항균효과를 보고한 바 있으며, 최근 Dai et al.,(2021)은 L. pentosus가 생산하는 bacteriocin의 그람 양성균과 그람 음성균에 대한 광범위한 항균 활성을 입증하였다. 본 연구결과는 L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE- K009의 다제내성 균주에 대한 항균효과를 입증하는 데 의의를 둘 수 있으며, 그람 양성 및 그람 음성균 모두 억제하는 효과가 있음을 확인하여 L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE-K009의 유용 유산균 자원으로써 가치가 있을 것으로 판단된다.

MIC 및 MBC 측정

Lee와 Kook(2021)의 연구에서는 분리한 kefir 유래 유산균 L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE-K009의 Staphylococcus spp., Escherichia spp., Pseudomonas spp. 등 지시균주 7주에서 우수한 항균효과가 있음을 보고하여, 본 연구에서는 다제내성 균주를 포함하여 지시균주 총 7주에 대한 항균효과를 확인하였다. L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE-K009는 다제내성 균주 중 그람 양성 및 그람 음성균 모두 억제하는 효과를 확인할 수 있었으며, 이에 다제내성균을 포함한 Staphylococcus spp., Escherichia spp. 등 7주에 대한 최소저해농도(MIC)와 최소살균농도(MBC)를 측정하였다(Table 3). 그 결과, L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE-K009의 모두 그람 음성균에 대한 MIC(>3.13-6.25 mg/mL) 및 MBC(6.25-12.50 mg/mL)가 그람 양성균에 대한 MIC(>3.13-12.50 mg/mL) 및 MBC(6.25- 25.00 mg/mL)보다 더 우수한 것으로 나타났다.

Table 3. Determination for MIC and MBC of Lactiplantibacillus pentosus BMSE-K006 and K009 against multidrug-resistant bacteria
Strains MIC1) (mg/mL) MBC2) (mg/mL)
K006 K009 K006 K009
Gram + Staphylococcus aureus KCCM 11335 >12.50 >12.50 25.00 25.00
Staphylococcus aureus 285 CCARM 0204 >3.13***3) >6.25 6.35*** 12.50
Staphylococcus aureus 503 CCARM 0205 >3.13*** >6.25 6.25*** 12.50
Gram - Escherichia coli KCTC 2571 >3.13*** >6.25 6.25*** 12.50
Escherichia coli 078 CCARM 0230 >3.13*** >6.25 6.25*** 12.50
Escherichia coli DC 0 CCARM 0237 >3.13 >3.13 6.25 6.25
Escherichia coli 1507 CCARM 0236 >6.25 >3.13*** 12.5 6.25***

1) MIC; minimum inhibitory concentration,

2) MBC; minimum bactericidal concentration,

3) Data showed mean of MIC and MBC. p values refer to the analysis by unpaired t-test.

*** p<0.05: K006 vs K009 by unpaired t-test.

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그람 양성균인 S. aureus KCCM 11335의 경우, L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE-K009의 MIC는 >12.50 mg/mL, MBC는 25.00 mg/mL로 나타났으며, 다제내성 균주인 S. aureus 285 CCARM 0204와 S. aureus 503 CCARM 0205의 경우, L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE-K009의 MIC는 각각 >3.13 mg/mL, >6.25 mg/mL, MBC는 각각 6.35 mg/mL, 12.50 mg/mL로 나타나, L. pentosus BMSE- K009 보다 L. pentosus BMSE-K006의 항균효과가 더 우수한 것으로 확인되었다. 그람 음성균인 E. coli KCTC 2571, E. coli 078 CCARM 0230의 경우, L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE-K009의 MIC는 각각 >3.13 mg/mL, >6.25 mg/mL, MBC는 각각 6.25 mg/mL, 12.50 mg/mL로 나타나, L. pentosus BMSE-K009 보다 L. pentosus BMSE-K006의 항균효과가 더 우수한 것으로 확인되었다. 다제내성 균주 E. coli DC 0 CCARM 0237의 경우, L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE- K009의 MIC는 모두 >3.13 mg/mL, MBC는 6.25 mg/mL로 동일하였으며, E. coli 1507 CCARM 0236의 경우, L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE-K009의 MIC는 각각 >6.25 mg/mL, >3.13 mg/mL, MBC는 각각 12.50 mg/mL, 6.25 mg/mL로 나타나, L. pentosus BMSE-K009의 항균효과가 더 우수한 것으로 확인되었다. 따라서, 본 연구에서는 kefir 유래 유산균 L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE-K009의 다제내성 균주에 대한 우수한 항균효과를 입증할 수 있는 기초자료가 될 것으로 판단된다.

요 약

본 연구에서는 선행연구를 통해 병원성 박테리아의 억제효과가 입증된 kefir 유래 유산균 L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE-K009의 다제내성 균주를 포함하는 Staphylococcus spp., Escherichia spp. 등 총 7주에 대한 억제효과를 확인하고자 하였다. L. pentosus BMSE-K006과 L. pentosus BMSE-K009는 대체로 다제내성 균주 중 그람 음성균에 대한 억제효과가 더 큰 것으로 확인되었으며, E. coli 1507 CCARM 0236을 제외한 모든 지시 균주에서 L. pentosus BMSE-K009보다 L. pentosus BMSE- K006의 항균효과가 더 우수한 것으로 확인되었다. 본 연구는 kefir 유래 유산균의 다제내성 균주에 대한 우수한 항균효과를 입증할 수 있는 기초자료가 될 수 있으며, 추후 probiotics 특성 및 안전성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.

Acknowledgments

본 연구는 2019년도 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단 이공분야 기초연구사업의 지원으로 수행되었다(과제번호; NRF-2019R1FA105839).

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