대추 열수 추출물의 항산화 및 영양학적 특성에 대한 Lactiplantibacillus plantarum 발효의 영향

본 실험에 사용된 대추(Zizyphus jujuba Miller)는 시중에 판매하고 있는 충북 보은군에서 재배한 건대추를 구입하였고, 구입 후 냉동보관(-20°C)하여 실험 시에 24(±2) 시간 동안 냉장(4°C) 상태에서 해동시킨 후 사용하였다. 실험에 사용된 유산균주는 Lactiplantibacillus plantarum(ATCC 14917)이었으며 충북농업기술원으로부터 분양받았다. 본 균주는 실험에 사용하기 전 멸균된 Lactobacilli MRS Broth(Difco, Sparks, MD, USA)에서 24시간 동안 2번 연속 계대배양하여 사용하였다.

대추 2 kg을 흐르는 물에서 3∼5분간 세척한 후 면포에 담아 스테인리스 추출 탱크에 넣고 대추가 들어 있는 탱크에 14 L의 물을 첨가한 후에 추출물의 양이 약 10 L가 되도록 3∼4시간 동안 끓여 냉각시킨 것을 1차 대추 열수추출물(1^st jujube hot water extract; 1^st JHWE)로 하여 실험에 사용하였다. 2차 대추 열수 추출물(2^nd jujube hot water extract; 2^nd JHWE)은 1차 추출을 완료한 대추에 14 L의 물을 다시 첨가하고 1차 추출 방식과 동일한 방법으로 추출하여 냉각시킨 것으로 하였다.

대량의 대추 열수추출물에 유산균을 접종하기 전 예비 배양을 위해 0.5 mL의 L. plantarum 배양액(8∼9 Log CFU/mL)을 50 mL의 1차 및 2차 대추 열수추출물에 접종(6∼7 Log CFU/mL)하여 30°C 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 예비 배양 후 대추 열수추출물 총량의 1%에 해당하는 양의 예비 배양액(8∼9 log CFU/mL)을 1차 및 2차 대추 열수추출물에 접종하여 30°C에서 발효를 진행하였으며 각각 1차 대추 열수추출물의 발효물(1^st jujube hot water extract fermented product; 1^st JHWE-F)과 2차 대추 열수추출물의 발효물(2^nd jujube hot water extract fermented product; 2^nd JHWE-F)로 실험에 사용하였다. 3일의 본 발효 기간 동안 12시간 간격으로 시료를 취하여 유산균 수의 변화를 분석하였는데, 발효 기간에 따른 유산균 수의 변화는 10배 계열 희석법에 따라 시료를 적절히 희석하여 Petrifilm™ LAB (3M, Saint Paul, MN, USA)을 이용해 측정하였으며 도말된 Petrifilm은 24∼48시간 동안 37°C에서 배양되었다.

당도는 당도계(Refractometer PAL-α, Atago, Tokyo, Japan)를 이용해 측정하였고 유산균 발효 유무에 따른 대추 열수추출물의 pH는 pH meter(Orion Star A211, Thermo Scientific, MA, USA)로 측정하였다. 총산도를 측정하기 위해 대추 열수추출물과 발효물의 시료 10 mL에 0.1% Phenolphthalein(Samchun, Pyeongtaek, Korea) 지시약을 3∼4 방울 첨가하고, 0.1N NaOH (Samchun, Pyeongtaek, Korea) 용액으로 중화액의 색이 연분홍이 나타날 때까지 적정하였으며, 소비된 양은 Lactic acid 함량식(%)으로 하여 총산도를 계산했다. 당도와 pH 및 총산도는 연속해서 3회 측정 후 평균값으로 나타내었다.

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법(Folin 등, 1912)을 사용하여 측정하였다. 대추 열수추출물과 발효물의 시료 100 μL를 시험관에 취하여 이에 2% NaCO₃(Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA)용액 2 mL를 가한 후 혼합하여 3분간 실온에서 방치하였다. 시료에 50% Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma) 100 μL를 첨가해 실온의 암실에서 30분간 반응시킨 후 Microplate reader (EPOCH2, Bio Tek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 750 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대추 열수추출물과 발효물의 총 폴리페놀 함량을 정량하기 위해 Gallic acid(Sigma-Aldrich)를 농도별로 희석하여 검량선을 작성한 표준곡선을 이용하였다.

DPPH free radical 소거 활성의 측정을 위해 우선 0.2 mM 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 시약(Alfa Aesar, Ward Hill, MA, USA)을 95%(v/v) Ethanol에 용해하여 DPPH 용액을 제조하였다. DPPH 용액을 시험관에 0.8 mL씩 분주하고 이에 0.2 mL의 시료를 첨가하여 암실의 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 520 nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며 DPPH radical 소거능의 산출은 아래의 식을 이용하여 백분율(%)로 나타내었다.

ABTS [2,2’-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)](Sigma-Aldrich)radical 소거활성 측정을 위해, 7.4 mM의 ABTS와 potassium persulfate(Sigma-Aldrich) 2.6 mM을 증류수에 용해하여 1:1 비율로 혼합하였다. 그 후 혼합용액을 24시간 동안 실온의 암실에서 방치하여 ABTS cation radical(ABTS⁺)을 형성시켰으며 이 ABTS⁺ 용액을 735 nm에서의 흡광도 값이 0.7±0.05가 되도록 희석하여 실험에 사용하였다. 희석된 ABTS⁺ 용액을 시험관에 1 mL씩 분주하고 이에 시료를 50 μL씩 가하여 60분 동안 방치한 후 735 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. ABTS radical 소거능은 아래의 계산식을 이용해 산출하여 백분율(%)로 나타내었다.

대추 2차 열수추출물의 유산균 발효 여부에 따른 영양성분은 열량, 나트륨, 탄수화물, 당류, 조지방, 트렌스지방, 포화지방, 콜레스테롤, 조단백질, 수분, 회분에 대해 분석하였으며, 한국표준시험분석연구원에 의뢰하여 결과를 얻었다.

각 실험의 결과는 독립적인 3회 반복 실험을 통해 얻어진 평균과 표준편차로 나타내었고, 통계처리는 SPSS Statistics software v.21.0 (IBM, Armonk, NY, USA)을 이용하여 시료 간의 차이를 ANOVA를 이용하여 p<0.05 수준에서 분석하였으며, Duncan’s Multiple Range Test로 사후 검증하였다.

L. plantarum을 배양시킨 예비 배양액을 1차 및 2차 대추 열수추출물에 접종한 다음 30°C에서 3일간 발효시키는 동안의 유산균 수 변화는 Fig. 1과 같다. 열수추출물에 접종한 L. plantarum의 초기 균수는 약 6.2∼6.5 Log CFU/mL였으며 접종 후 12시간 만에 약 7.5∼7.7 Log CFU/mL로 증가하여 정지기에 도달하였다. 배양 36시간 후에는 유산균 수가 7.7∼8.1 Log CFU/mL에 이르렀으며, 72시간까지의 배양 기간 동안 유산균 수의 큰 증감은 보이지 않았다. 따라서 다른 영양성분 첨가 없이 1차 및 2차 대추 열수추출물 모두에서 완만한 유산균의 생육이 이루어졌으며, 이는 대추가 당류를 높은 비율로 함유하고 있으므로 높은 당 농도에서 유산균의 생육이 가능했을 것으로 생각된다(Jo 등, 2015).

Fig. 1. Changes in the number of Lactiplantibacillus plantarum in jujube hot water extracts (1^st and 2^nd JHWE) during fermentation.

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Fig. 2는 대추 열수추출물과 유산균 발효물의 당도, pH 및 총산도의 값을 비교한 결과 값이다. 먼저 당도의 경우 1, 2차 대추 열수 추출물을 각각의 유산균 발효물과 비교했을 때 유의적인 차이(p>0.05)를 보이지 않았는데(Fig. 2A), 이는 Ryu 등 (2018)과 Kim 등 (2016)의 연구에서 발효 기간 동안 유산균에 의해 당이 소비되어 당도가 감소하였다는 결과와 달랐다. 반면 과채즙에 젖산균을 접종하여 9일간의 발효기간 동안 당도를 측정한 Kim 등 (2002)의 연구에서는 발효 4일째까지 당도의 변화가 없다가 6일째부터 서서히 감소되었다고 보고하였는데, 이의 결과는 본 연구와 유사한 경향을 보여, 본 실험에서 3일간의 추출물 발효 기간은 당도의 변화를 가져오기엔 불충분했을 것으로 사료된다. 대추 추출물의 pH 측정 결과, 유산균 발효 과정을 거치지 않은 1차 및 2차 대추 열수추출물은 pH 4.2∼4.5이었으나, 유산균 발효 이후 pH 2.6∼2.8로 현저히 저하되어 유의적(p<0.05)으로 낮은 값을 나타냈다(Fig. 2B). 이것은 유산균 발효가 진행됨에 따라 생성된 젖산이나 아세트산을 비롯한 여러가지 유기산 물질이 생성되어 pH가 급격히 감소된 것으로 보인다(Kim 등, 1999; Sung 등, 2013). 총산도 측정결과 2차 열수추출물의 유산균 발효물이 0.52로 가장 높은 산도를 나타내었고, 1차 열수추출의 유산균 발효물은 0.19로 열수추출물과 유의적 차이를 나타내지 않아(Fig. 2C) pH값과 다른 양상을 보였다. 일반적으로 유산균 발효가 진행됨에 따라 생산된 대사산물로 인해 pH가 감소하며 산도가 증가한다는 보고와는 다른 결과를 나타내어 추후 연구가 필요할 것으로 보인다(Kim 등, 2016; Han 등, 1997).

Fig. 2. Changes in sugar contents, pH, and total acidity of jujube hot water extracts (1^st and 2^nd JHWE) and their corresponding fermented products (1^st and 2^nd JHWE-F). ^(a,b) Different letters differ significantly (p<0.05).

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2차 대추 열수추출물의 유산균 발효여부에 따른 일반영양성분 분석 결과를 Table 1에 나타냈다. 수분은 시료 모두 평균 94%로 분석되었으며, 탄수화물 함량은 대추 열수추출물과 유산균발효물이 각각 7.10 g과 6.79 g였고, 당류 함량은 열수추출물이 6.35g, 유산균 발효물이 5.92g로 나타났다. 또한 열수추출물의 조지방과 조단백질 함량, 회분 함량은 각각 0.27g, 0.52g, 0.24%였으며, 유산균 발효물은 0.26g, 0.50, 0.19%를 나타내어 모든 일반영양성분에서 유의적 차이를 보이지 않았다(p>0.05). Gim 둥(2018)의 연구에서는 갈색거저리 동충하초 추출물을 유산균으로 발효하였을 때 회분 함량에서 유의적 차이를 보이지 않아 본 연구와 유사하였으나, 수분은 85.27%에서 약 17% 낮아진(p<0.005) 68.54%를 나타냈고, 조단백질(p<0.05)과 조지방(p<0.005)은 발효물이 물 추출물보다 높은 값을 나타내어 본 연구와 다른 경향을 나타냈다. 이는 실험재료 및 추출 방법의 차이가 결과 값에 영향을 주었을 것으로 보이는데, 특히 Gim 등의 연구에서는 유산균 발효물 제조 시, 감압 농축하여 사용하였으므로 수분함량 및 일반성분 함량에 변화를 주었을 것으로 사료된다.

DPPH radical 소거법은 비교적 안정한 free radical을 가지고 있는 DPPH가 ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 등의 방향족 화합물 및 방향족 아민류에 의해 환원되어 자색이 탈색되는 정도를 지표로 하여 항산화능을 측정하는 방법으로 천연소재로부터의 항산화물질을 검색하는데 주로 이용되고 있다(Kwon 등, 2007; Kim 등, 2016; Yu 등, 2006). Fig. 3은 1차 및 2차 대추 열수추출물의 유산균 발효 여부에 따른 DPPH free radical 소거능의 결과를 나타낸 것으로 본 실험에서는 대조구로 ascorbic acid를 사용하였다.

Fig. 3. DPPH radical scavenging activities of jujube hot water extracts (1^st and 2^nd JHWE) and their corresponding fermented products (1^st and 2^nd JHWE-F). ^(a,b) Different letters differ significantly (p<0.05).

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DPPH radical 소거 활성능은 유산균 비발효군의 경우, 1차 열수추출물이 20.37%였으며 2차 열수추출물은 48.90%로 나타나 1차 열수추출물보다 높았고, 유산균 발효군의 경우, 유산균 비발효군과 마찬가지로 2차 열수추출물의 발효물이 42.11%로 측정되어 1차 열수추출물의 발효물(20.34%)보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 또한 1차 및 2차 대추 열수추출물을 각각 유산균 발효물과 비교했을 때 모두 DPPH free radical 소거 활성능에서 유의적인 차이가 나타나지 않았는데(p>0.05), 이는 유산균 발효 유무와 관계없이 대추 열수추출횟수가 DPPH free radical 소거 활성능에 가장 영향을 많이 미친 것으로 보인다. Kim(2014) 등의 연구에서는 DPPH free radical 소거 활성능을 대추 추출물의 농도별로 측정한 결과, 대추 열수추출물 62.5 μg/mL에서 34.36%, 250 μg/mL에서 55.19%, 1,000 μg/mL에서 68.24%의 전자공여능을 보여 대추 열수추출물의 농도가 증가함에 따라 전자공여능이 증가하였다고 보고였는데, 이는 더 높은 농도의 2차 대추 열수추출물에서 DPPH free radical 소거 활성능이 증가한 본 연구와 유사한 경향을 보였다.

ABTS radical 소거법은 ABTS가 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS free radical이 시료 내의 항산화를 가지는 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 청록색이 탈색되는 것을 이용한 측정 방법으로(Choi 등, 2003), 본 연구에서는 ascorbic acid를 대조군으로 사용하여 항산화력을 측정하였다.

유산균 발효여부에 따른 1차 및 2차 대추 열수추출물의 ABTS free radical 소거 활성능의 결과는 Fig. 4에 나타내었다. 유산균 비발효군의 1차 열수추출물은 19.72%였으며 2차 열수추출물은 79.94%로 1차 열수추출물에 비해 ABTS free radical 소거 활성능이 더 높은 것으로 나타났다(p<0.05). 유산균 발효군에서도 마찬가지로 2차 열수추출물이 56.16%로 1차 열수추출물(15%)에 비해 유의적으로 높은 값을 보여(p<0.05) 대추 열수 추출횟수가 늘어남에 따라 ABTS free radical 소거 활성능이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. Choi(2006) 등의 연구에서 식물체를 열처리할 경우 결합형의 폴리페놀 성분이 유리형으로 전환되어 항산화 활성이 증가한다고 보고한 것과 같이 본 연구에서도 2차 열수추출물이 1차 추출물보다 더 오랜 시간 고온 열처리하였으므로 조직과 강하게 결합되어 있던 유효성분들이 유리형으로 전환되어 항산화 효과가 더 높게 측정되었을 것으로 판단된다. 반면, 1차 및 2차 열수추출물 모두 L. plantarum에 의한 발효에 의해서는 항산화능의 증가를 보이지 않았는데, 이는 Auh 등(2012)의 연구에서 건대추와 흑대추 추출물 모두 발효에 의한 ABTS free 라디칼 소거능의 유의적인 변화가 나타나지 않았다는 결과와 일치하였다.

Fig. 4. ABTS radical scavenging activities of jujube hot water extracts (1^st and 2^nd JHWE) and their corresponding fermented products (1^st and 2^nd JHWE-F). ^(a,b) Different letters differ significantly (p<0.05).

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폴리페놀(polyphenol)계 화합물은 한 분자에 2개 이상의 phenolic hydroxyl(OH)기를 가진 방향족 화합물들을 가리키는데 식물체에 특수한 색을 부여하고 산화-환원반응에서 기질로 작용한다. 또한 폴리페놀 화합물은 충치 예방 및 고혈압 억제, 항산화, 항암, 항염증 등의 다양한 생리활성을 갖는다고 알려져 있다(Yu 등, 2006). 따라서 본 연구에서는 열수추출물과 유산균 발효물의 총 폴리페놀 함량을 분석하였다(Fig. 5). 1차 열수추출물 및 발효물의 총 폴리페놀 함량은 0.36 mg/mL로 측정되었으며, 2차 열수추출물과 유산균 발효물은 0.16-0.18 mg/mL로 측정되어 1차 열수추출물에 비해 현저히 낮은 함량을 나타냈는데, 이는 대추 1차 열수추출물의 총 폴리페놀 함량이 11.63 mg/g으로 가장 높게 나타났고, 2차 열수추출물은 1차 추출물에 비해 약 60% 감소한 4.37 mg/g을 나타냈다고 보고한 Jeong 등(2011)의 연구와 유사하였다. 반면, Song 등(2011)은 톳 추출물을 L. brevis로 발효했을 때, 추출액의 가수분해로 인해 폴리페놀 함량이 크게 증가하였다고 보고하였는데, 본 연구에서는 1차 및 2차 열수추출물을 각 발효물과 비교했을 때 유의적인 차이(p>0.05)를 보이지 않았다. Doh 등(2010)의 6가지 유산균주로 인삼을 발효하여 특성 조사 및 효능 검정을 실시하고자 한 연구에서 유산균의 종류 및 발효시간에 따라 폴리페놀 함량이 증가 혹은 감소를 보였다고 하였다. 본 연구에서는 L. plantarum 단일 균주 및 한가지의 발효 조건으로 실험을 진행했기 때문에 유산균 발효에 의한 대추추출물의 기능성 확인을 위해서는 다양한 유산균주 및 발효조건을 적용, 비교할 수 있는 추가적인 연구가 필요할 것으로 여겨진다.

Fig. 5. Total polyphenol contents of jujube hot water extracts (1^st and 2^nd JHWE) and their corresponding fermented products (1^st and 2^nd JHWE-F). ^(a,b) Different letters differ significantly (p<0.05).

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