γ-Aminobutyric Acid 생산 유산균을 이용한 기능성 발효 두유 제조

본 연구에서 사용된 두유 분말, 분리대두단백(ISP), 프럭토올리고당, 결정과당은 ㈜바이셀(괴산, 한국)에서 제공받아 사용하였으며, 단백질 분해효소는 아피스바이오켐 사(社)의 Protamex(100g), Flavourzyme 500MG(100g)를 사용하였다. GABA 생성 균주는 선행연구를 통하여 자연치즈에서 분리한 Lactobacillus plantarum LP2 균주를 사용했으며, 생육배지로 MRS broth(BD, Sparks, MD, USA)를 사용하였다. 균주는 –75°C 초저온냉동고(㈜일신바이오베이스, 동두천, 한국)에 보관하면서 실험에 사용하기 전에 2회 이상 계대배양하여 활성화시킨 후 사용하였다.

L. plantarum LP2 균주의 GABA 생성능 확인을 위해 MRS broth(BD)에 Monosodium glutamate(MSG, Sigma-Aldrich, USA)를 3% 첨가한 후 멸균하여 사용하였으며, 이에 균주를 1%(v/v) 접종하고 37°C에서 0, 24, 48시간 배양한 후 배양액을 취해 원심분리(13,000rpm, 5분)하고, 상등액을 주사여과(0.45μm; ANYLAB)하여 시료로 사용하였다. GABA 분석은 박층크로마토그래피(thin layer chromatography; TLC)법으로 수행하였으며, silica gel 60 F₂₅₄ TLC plate(10×20cm)(MACHEREY-NAGEL, Duren, Germany)를 사용하였다. 전개용매는 n-부탄올: 아세트산: 물을 4:1:1 (v/v/v) 비율로 혼합하여 사용하였으며, 2시간의 전개 후 TLC plate를 80°C에서 15분간 건조하였다. 이 과정을 1회 더 반복하였다. 이후 0.2% ninhydrin 용액(에탄올 용해)에 넣고 10분간 건조한 후 GABA 표준물질(Sigma-Aldrich)의 위치와 비교하였다.

3% MSG가 함유된 MRS 배지에서 GABA 생성능이 확인된 L. plantarum LP2 균주가 두유에서 GABA를 생성하는지 확인하였다. 두유 분말(10%, w/v)과 프럭토올리고당(5%, w/v)을 이용하여 두유를 제조한 뒤, 85°C, 30분 조건에서 살균하였다. 이에 L. plantarum LP2 균주를 최종농도 1%(v/v)로 접종한 후 경시적(0, 12, 24, 48, 72시간)으로 생균수, pH 및 GABA 생성능을 확인하였으며, 생균수 및 pH 측정은 3반복 실험을 수행하여 평균값으로 나타내었다.

GABA의 생산량을 높이기 위하여 유리 아미노산의 확보 차원에서 ISP를 단백질분해효소로 처리하였다. Cha와 Yoon의 방법(Cha and Yoon, 1993)을 변형하여 ISP(8%, w/v)와 결정과당(2%, w/v) 용액(200mL)에 단백질 분해효소(Protamex, Flavourzyme)를 첨가한 후 항온수조(50°C, 100rpm)에서 반응하였다. 이후 항온수조의 조건(80°C, 10분)을 변경하여 효소를 불활성화시켰다. 단백질의 분해 정도를 확인하기 위하여 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 수행하였다.

기능성 발효 두유를 제조하기 위하여 두유분말, 효소처리 ISP, 프럭토올리고당, 결정과당을 적절한 농도로 첨가하여 두유를 제조한 후 L. plantarum LP2 균주를 접종하였다. 이후 경시적(0, 24, 48시간)으로 생균수 및 pH를 측정하였으며, 시료를 취해 원심분리(13,000rpm, 5min)하고 그 상등액을 주사여과(0.45μm; ANYLAB) 한 후 동결건조하여 TLC 분석을 수행하였다. 생균수 및 pH 측정은 3반복 실험을 수행하여 평균 값으로 나타내었다.

MRS 배지와 3%(w/v) MSG가 첨가된 MRS 배지에 L. plantarum LP2를 1%(v/v) 접종한 뒤 37°C에서 배양하면서 경시적(0, 24, 48시간)으로 GABA의 생성능을 TLC 분석으로 확인하였다. 그 결과, MSG 무첨가 배지에서는 GABA가 확인되지 않은 반면, MSG가 첨가된 배지에서는 GABA가 확인되어 사용한 L. plantarum LP2 균주가 MSG를 활용하여 GABA를 생산하는 능력이 있는 것으로 확인되었다(Fig. 1).

Fig. 1. Thin layer chromatography of samples from fermentation of Lactobacillus plantarum LP2 cultured in MRS broth supplemented with 3% monosodium glutamate (MSG) or not. GABA, γ-aminobutyric acid.

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두유 분말(10%, w/v)과 프럭토올리고당(5%, w/v)이 함유된 두유에 L. plantarum LP2 균주를 접종한 후 37°C에서 배양하면서 경시적으로 생균수와 pH를 측정하였을 때, 12시간째에 정상기(stationary phase)에 도달하여 9.2 Log CFU/mL의 생균수를 나타냈으며, 24시간째 pH는 3.7까지 떨어졌으며 이후 유지되었다(Fig. 2). 또한 TLC 분석 결과, 미미하지만 경시적으로 GABA 함량이 증가되는 것을 확인하였다(Fig. 3).

Fig. 2. Viable cell count (A) and pH (B) during fermentation of L. plantarum LP2 in soymilk medium including 10% soy powder and 5% fructooligosaccharide.

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Fig. 3. Thin layer chromatography of samples from fermentation of Lactobacillus plantarum LP2 cultured in soymilk medium including 10% soy powder and 5% fructooligosaccharide.

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유리 아미노산의 확보를 위해 ISP를 상업적 효소를 활용하여 분해하였다. 분해 정도는 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다. 그 결과, Flavourzyme은 3시간 반응 시 완전히 분해되는 반면, Protamex는 처리 후 즉시 ISP가 완전히 분해되는 것으로 확인되어 Protamex의 효율이 훨씬 우수한 것으로 나타났다(Fig. 4).

Fig. 4. Protein profiles of digested isolated soy protein (ISP) by enzymes Flavourzyme and Protamex on SDS-PAGE gels. A, Flavourzyme (0.2%); B, Protamex (0.2%); C, Flavourzyme (0.1%) + Protamex (0.1%). M, size marker; N, no treatment; 0, just after treatment; 1-3, 1-3 h after treatment.

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두유분말, 효소처리 ISP, 프럭토올리고당, 결정과당을 적절한 농도로 첨가하여 두유를 제조한 후 L. plantarum LP2 균주를 접종하였다. 37°C에서 배양하면서 경시적으로 생균수와 pH를 측정한 결과, 24시간째 정상기에 도달하여 9.3 Log CFU/mL의 생균수를 나타냈으며, pH는 24시간째 4.2까지 떨어졌으며 이후 유지되었다(Fig. 5). GABA 함량의 경우, 두유 자체에서는 GABA가 검출되지 않았지만 L. plantarum LP2 균주로 발효한 두유의 경우 경시적으로 GABA 함량이 증가되었다(Fig. 6).

Fig. 5. Viable cell count (A) and pH (B) during fermentation of L. plantarum LP2 in the modified soymilk medium including soy powder, ISP, fructooligosaccharide, and fructose.

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Fig. 6. Thin layer chromatography of samples from fermentation of Lactobacillus plantarum LP2 cultured in the modified soymilk medium including soy powder, ISP, fructooligosaccharide, and fructose. MSG, monosodium glutamate; GABA, γ-aminobutyric acid; Control, no inoculation; LP2, L. plantarum LP2 strain was inoculated.

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