김치 유래 유산균의 발효유 스타터로서의 가능성 평가

김치 시료는 Lactobacilli MRS broth(Difco Co., Sparks, MD, USA) 1 mL에 1%(v/v)로 접종하여 30℃에서 24시간 종균 배양하였다. 이후 MRS broth 1mL에 1%(v/v)로 접종하여 30℃에서 24시간 본 배양하였다. 이후 유산균 감별 배지인 Bromo Cresol Purple(BCP) plate count agar(EIKEN chemical, Tokyo, Japan)에 획선도말하여 30℃에서 48시간 배양하였고, 산을 생성하여 colony 주위에 노란색 환을 형성한 것을 취해 순수 분리하였다. 이후 16S rRNA 염기서열을 분석하여 최종 동정하였다(BIOFACT Co., Daejeon, Korea). 염기서열 분석을 위해 사용한 pirmer는 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 및 1492R(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')이며, 분석한 염기서열은 EZBioCloud website(www.ezbiocloud.net)의 16S database tool을 기반으로 표준 균주의 염기서열과 비교하였으며, 계통수(phylogenetic tree)는 MEGA11 프로그램의 neighbor-joining 방법을 사용하여 작성하였다.

분리한 균주들의 탄수화물 이용성을 확인하고자 API 50 CHL kit(50300, BioMérieux, France)를 사용하였다. MRS broth 1 mL에 1%(v/v)로 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 균 배양액을 12,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 phosphate buffer saline(PBS)로 3회 washing하였다. 이후 suspention medium(BioMérieux, France)에 2 McFarland standard solution의 농도로 현탁시켜 탁도를 맞춘 후, API 50 CHL kit의 각 tube에 상기 균주를 200µL씩 분주한 후 각 큐플에 mineral oil을 2방울 정도 떨어뜨렸다. 이후 30°C에서 24시간 동안 배양하였으며, API 웹사이트(http://apiweb.biomerieux.com)에서 제공하는 판독표를 기준으로 49가지의 탄수화물 발효 여부를 확인하였다. API 50 CHL 결과는, 유산균이 스트립 내의 탄수화물 기질을 이용하여 만들어내는 젖산에 의하여 bromocresol purple 지시약의 색이 보라색에서 노란색으로 바뀜에 따라 그 정도의 차이를 + (활성 있음), ++ 및 +++ (강한 활성), w (약한 활성) 과 – (활성 없음)로 표기하였다.

분리한 균주들의 효소 활성을 확인하고자 API ZYM kit(25200, BioMérieux, France)를 사용하였다. MRS broth 1mL에 1%(v/v)로 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 균 배양액을 12,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 phosphate buffer saline(PBS)로 3회 washing 하였다. 이후 suspention medium(BioMérieux, France)에 5-6 McFarland standard solution의 농도로 현탁시켜 탁도를 맞춘 후, API ZYM kit의 각 tube에 상기 균주를 65 µL씩 분주하고 알루미늄 호일로 감싸 빛을 차단한 후 30°C에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 ZYM A 시약과 ZYM B 시약을 각각 한 방울씩 떨어뜨린 후 5분간 반응시켰으며, API 웹사이트(http://apiweb.biomerieux.com)에서 제공하는 판독표를 기준으로 19가지의 기질 이용 여부에 따라 효소 활성을 확인하였다. API ZYM 결과는, ZYM A 시약과 ZYM B 시약 첨가 후 판독표를 기준으로 색의 정도의 차이에 따라서 + (활성 있음), ++ 및 +++ (강한 활성), w (약한 활성) 과 – (활성 없음)로 표기하였다.

각각의 분리 균주를 MRS broth 30 mL에 5%(v/v)로 접종한 후 30°C에서 배양하면서 3시간 간격으로 시료를 채취하였다. 채취한 시료는 UV-Vis Spectrophotometer(OPTIZEN POP, Mecasys, South Korea)를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 동시에 pH meter(Seven Compact Duo S213, Mettler Toledo, Switzerland)를 사용하여 균 배양액의 pH를 측정하였다.

본 실험에서 분리한 균주인 LK013, LK019, LK030 및 P215의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과, LK013은 Lactiplantibacillus pentosus DSM 20314^T와 99.79%, LK019는 Pediococcus pentosaceus DSM 20336^T과 99.86%, LK030은 Levilactobacillus brevis ATCC 14869^T와 99.72% 및 P215는 Levilactobacillus brevis ATCC 14869^T와 99.59%의 유사도를 보이는 것으로 확인되어 각각 Lactiplantibacillus pentosus LK013, Pediococcus pentosaceus LK019, Levilactobacillus brevis LK030 및 Levilactobacillus brevis P215로 명명하였다(Fig. 1).

Fig. 1. The neighbor-joining phylogenetic tree of strains (A) Lactiplantibacillus pentosus LK013, (B) Pediococcus pentosaceus LK019, (C) Levilactobacillus brevis LK030, and (D) Levilactobacillus brevis P215 from a comparative analysis of 16S rRNA gene sequences. Bootstrap values (expressed as a percentage of 1,000 replications) > 65% are shown at the branch points. Bar, 0.01 substitutions per nucleotide position).

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전통발효식품인 김치로부터 분리한 유산균의 발효유 스타터로서의 이용 가능성을 확인하기 위하여 각각의 분리 균주를 대상으로 49종의 탄수화물 이용성을 확인하였다. P. pentosaceus LK019는 본 연구에서 분리한 다른 균주에 비해 L-arabinose, L-rhamnose, N-acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin 및 gentiobiose와 D-ribose, D-xylose, D-galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, D-cellobiose, D-maltose 및 D-trehalose와 같은 D-form 탄수화물의 이용성이 더 높았으며 Bajpai 등(2016)의 연구에 사용된 P. pentosaceus 4I1 및 Oh 등(2014)의 연구에 사용된 P. pentosaceus와 동일하게 L-arabinose, N-acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, salicin, gentiobiose, D-ribose, D-galactose, D-glucose, D-fructose, D-cellobiose, D-maltose 및 D-trehalose를 이용하는 것으로 확인되었다. P. pentosaceus는 동형 발효균으로, 본 연구에서 분리한 P. pentosaceus LK019 또한 동형 발효균의 특징으로 인해, 기질로서 pentose인 L-arabinose, D-ribose를 이용할 수 있음을 확인하였다(Dobrogosz and Demoss, 1963). 반면에 L. brevis는 이형 발효균으로서 hexose 및 pentose을 대사하여 초산과 젖산을 생산할 수 있는 것으로 알려져 있으며(Kandler, 1983), 본 연구에서 분리한 L. brevis LK030과 L. brevis P215는 공통적으로 pentose인 L-arabinose, D-ribose 및 D-xylose와, hexose인 D-galactose, D-glucose 및 D-fructose를 이용할 수 있는 것으로 확인되었다. 하지만 두 균주는 같은 species임에도 불구하고 이용 가능한 탄수화물의 종류가 상이하였다. 이러한 결과는, 16S rRNA 유전자 염기서열 분석은 유전체 분석과 달리 유전자의 일부 구간만을 분석한 것이므로, 분석결과 100%의 유사도를 보이더라도 서로 다른 유전자를 갖고 있을 수 있기 때문으로 판단된다. 마지막으로 L. pentosus LK013은 Lee 등(2017b)의 연구결과와 유사하게 L-arabinose, D-ribose, D-glucose, D-fructose, N-acetyl-glucosamine, esculin, D-cellobiose, D-maltose, D-melibiose, D-trehalose, D-raffinose, gentiobiose 및 D-turanose를 이용하는 것으로 확인되었다(Table 1).

본 연구에서는 API ZYM kit를 사용하여 탄수화물, 단백질, 지질 등의 대사에 관여하는 서로 다른 19가지 효소에 대하여 각각의 분리 균주들의 효소활성을 확인함으로써 발효유 스타터로서의 이용 가능성을 확인하였다. P. pentosaceus LK019는 Zommiti 등(2018)의 연구에서 발견된 균주인 P. pentosaceus MZF16과 동일하게 강력한 leucine arylamidase, valine arylamidase, N-acetyl-β-glucosaminidase 및 β-glucosidase 활성을 나타 내었으며, L. pentosus LK013 또한 상기 효소 활성이 있음을 확인하였다. 그 중 β-glucosidase는 배당체 형태의 화합물을 비배당체 형태의 화합물로 가수분해하는 특성을 가지고 있어, 소화 흡수율을 높여 식품 산업의 다양한 분야에서 활용되고 있다(Chun et al., 2008). 대표적으로 식품에 함유되어 있는 배당체 화합물의 예로는 이소플라본(isoflavone)과 사포닌(saponin) 등이 있다. 이소플라본은 콩에 존재하는 피토케미컬(phytochemical)로 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)이며, 여성 호르몬인 에스트로겐과 구조 및 생리활성이 매우 유사하다(Vitale et al., 2013). 또한 이소플라본은 갱년기 여성의 골다공증과 고지혈증 개선뿐만 아니라, 항산화 및 항암 효과 등을 나타내는 것으로 보고된 바 있다(Ewies, 2002). 사포닌을 함유하고 있는 식품에는 콩, 더덕, 도라지 및 칡 등이 있지만, 가장 함유량이 많은 식품은 인삼이다. 인삼의 주요 약리성분으로 알려져 있으며, 인삼 사포닌인 진세노사이드(ginsenoside)는 면역 기능 조절, 항암 효과 및 항당뇨 효과 등 우수한 생리활성을 가진 것으로 보고되어 있다(Benishin et al., 1992; Mei et al., 1994; Saito et al., 1988). 하지만 이소플라본과 진세노사이드는 대부분 식품에 배당체 형태로 존재하기 때문에 체내 흡수율이 낮다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 최근 들어 Pediococcus pentosaceus 균주를 이용하여 칡 추출물에 함유된 이소플라본을 저분자 물질인 다이하이드로다이드제인(dihydrodaidzein)으로 전환한 연구(Lee et al., 2013c), 대두의 이소플라본을 Lactobacillus plantarum과 Bifidobacterium longum 균주를 이용하여 비배당체로 전환한 연구(Kim et al., 2010d) 및 배당체 형태의 진세노사이드 Rb1과 Rb2를 Leuconostoc mesenteroides 균주를 이용하여 비배당체 형태의 진세노사이드 Rg3로 전환한 연구(Shim et al., 2014) 등 유산균을 이용하여 배당체를 비배당체로 전환하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 따라서 유산균을 활용한 발효유 스타터의 개발은 스타터 자체로 이용할 수 있을 뿐만 아니라 유산균이 생산하는 생리활성 물질에 의한 기능성 효과를 기대할 수 있을 것이라 판단된다. L. brevis LK030과 L. brevis P215는 매우 유사한 효소 활성을 가진 것으로 확인되었으며 지질 가수분해 효소인 esterase 및 esterase lipase에 대한 활성과 인간의 위장과 소장에서 소화되고 흡수되지 않는 raffinose와 stachyose를 분해하는 α-galactosidase에 대한 활성을 가지고 있는 것으로 확인되었다(Table 2).

유산균을 이용한 발효유는 유산균이 생장하면서 만들어내는 젖산에 의한 낮은 pH가 장내 유해세균을 억제하고 유익한 세균의 성장을 촉진할 뿐만 아니라 숙주의 면역력을 높여주고, 성인병 예방에 기여하는 등의 건강 증진 효과가 있다. 따라서 본 연구에서는 배양시간에 따른 흡광도 및 pH 측정 결과를 기반으로 하여 분리된 각 균주의 생육특성을 확인함으로써 발효유 스타터로서의 이용 가능성을 확인하였다(Fig. 2). L. pentosus LK013 균주는 배양 6시간부터 대수 증식기에 접어들어 21시간에서 24시간 사이에 최대 증식을 나타내었으며, 이때의 pH는 젖산 및 초산과 같은 산의 생성으로 인해 3.61까지 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. P. pentosaceus LK019 균주 또한 21시간에서 24시간 동안 균의 성장률이 최대치에 도달하였으며, 이에 따라 pH가 3.48까지 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. L. brevis LK030 및 P215 균주는 6시간부터 대수 증식기에 진입하여 24시간에 최대 증식을 보였다. L. pentosus LK013, P. pentosaceus LK019, L. brevis LK030 및 P215 균주의 균수는 각각 배양 18시간차에 3.23±0.07×10⁹ CFU/mL, 4.17±0.40×10⁹ CFU/mL, 3.87±0.35×10⁹ CFU/mL 및 2.55±0.13×10⁹ CFU/mL인 것으로 확인되었다. 특히 L. brevis LK030 및 P215 균주는 본 연구에서 분리한 다른 균주와 비교하였을 때, 증식에 비해 상대적으로 낮은 pH를 나타내었다. Bae 등 (2004)에 따르면 유산균의 종에 따라 생장 양상 및 pH의 경향이 다르게 나타난다고 보고한 바 있다. LK030과 P215 균주의 생육이 다른 두 균주에 비해 낮은 이유도 이와 같은 결과와 일치하는 것으로 판단된다. Lonner와 Preve(1989)의 연구에 따르면 이형발효 특성을 가진 L. brevis가 다른 균주보다 산 생성량이 가장 많다고 보고한 바 있다. 이러한 분리 균주들의 산 생산에 따른 낮은 pH는 발효유 제조 시 병원성 세균 및 이취를 내게 하는 세균의 성장을 억제하는 효과를 가지고 있어 스타터 균주로서 가치가 있다고 판단된다.

Fig. 2. Growth profile of (A) Lactiplantibacillus pentosus LK013, (B) Pediococcus pentosaceus LK019, (C) Levilactobacillus brevis LK030, and (D) Levilactobacillus brevis P215. ●; cell growth, ■; pH. Data are presented as mean ± SD (n=3).

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