특수환경으로부터 세포외 지방분해효소를 생산하는 바실러스 서브틸리스 균주의 분리 및 특성에 관한 연구

국내 다양한 특수환경(해수, 토양, 제주목장, 온천, 염전, 발효식품 등)으로부터 내염성 특이 B. subtilis를 분리하기 위해 각각의 샘플을 멸균된 0.85% (w/v) 생리식염수에 첨가하여 vortexing하였다. 현탁한 샘플 1 mL를 사용하여 10⁻¹‒10⁻⁴ 배로 단계 희석한 후, 일반 증식배지로 해양미생물 전용배지인 marine agar (BD, USA) 배지(3%(w/v) 염 포함)를 활용하여 고체배지를 제작해 희석액을 도말하여 37°C에서 호기적으로 배양하였다. 배양 후 선택적으로 배지상에 나타나는 균의 크기, 모양, 색깔 등 형태학적 모습을 관찰한 후, 동일한 고체배지를 사용하여 추가적으로 single colony isolation을 수행하였다. 국내외 다양한 환경시료로부터 호기적 배양 조건에서 분리된 균주들의 분자생물학적 동정을 위해 marine agar (BD, USA) 배지에 각각 분리된 균주의 colony가 배양된 상태의 고체 배지를 ㈜바이오팩트(Daejeon, Korea)에 보내어 16S rRNA를 코딩하는 유전자 염기서열을 분석하였으며, 가장 유사한 근연 균주의 확인을 위하여 ㈜천랩의 EzBioCloud (https://www.ez biocloud.net/)를 사용하였다(Yoon et al., 2017). 계통학적 분석은 Clustal W 및 MEGA 11.0 프로그램을 이용하여 확인하였다(Tamura et al., 2021). 순수분리된 균주의 혼합배지에서의 생육 가능성을 확인하기 위하여, nutrient agar (BD, USA), R2A agar (BD, USA) 및 tryptic soy agar (BD, USA)에 평판 도말법을 이용하여 37°C에서 7일간 정치 배양을 하였다. 그리고 분리된 균주들이 호염성 균주로서 5‒15%(w/v) NaCl 농도에서도 생육이 가능한지를 확인하기 위하여 marine agar 배지에 NaCl을 최종 5‒15%(w/v) 되도록 첨가하여 분리 균주들의 생육을 확인하였으며, 최적 생육 pH 조건을 확인하기 위하여 pH를 4.0, 7.0, 9.0 로 각각 조절한 marine agar 배지를 사용하였으며, 최적의 생육 온도 조건을 확인하기 위해 동일한 배지를 사용하여 30, 35, 40, 45, 50, 55°C에서 7일간 배양하였다.

분리된 균주의 산업적 응용을 위한 세포외 분해 효소 amylase, lipase, protease 활성을 확인하기 위하여 각각의 효소와 특이적으로 반응할 기질 성분이 포함된 고체평판 선별배지를 사용하였다. 먼저 amylase 활성에 의한 분해능은 0.2%(w/v) soluble starch (BD, USA)를, lipase 활성에 의한 분해능은 1%(v/v) Tween 80 (BD, USA)을, protease 활성에 의한 분해능은 2%(w/v) skim milk (BD, USA)를 기질로 선택하여 marine agar (BD, USA) 배지에 각각 첨가하여 제조하였으며, 분리된 균주를 직접 접종하여 37°C에서 7일간 배양한 후 amylase와 protease 활성은 clear zone, lipase 활성은 opaque zone의 직경으로 조사하였다. 분리된 균주의 효소활성 분해능 평가는 배양 후 나타나는 접종균 주위의 억제환의 크기(+++ : > 7 mm, ++ : > 4~7 mm, + : 1~4 mm, ‒ : < 1 mm)로 나타내었다.

국내 다양한 특수환경시료로부터 특이 B. subtilis 균주 분리를 위하여 marine agar 배지에 희석한 시료를 도말하여 배양된 콜로니를 다시 동일한 고체배지를 사용하여 2차로 단일 콜로니를 분리한 결과, 61종의 B. subtilis 균주를 순수하게 분리․동정하였으며, 이 중 10%(w/v) 염 환경에서 생육 가능한 내염성 26종, 45-50°C에서 생육 가능한 고온성 15종, amylase 활성 59 종, protease 활성 28종, lipase 활성 4종이 확인되었다(data not shown). 지방분해효소 활성이 확인된 4종의 B. subtilis 균주를 선별하였다(Fig. 1 and Fig. 2). 4종의 균주는 각각 여수 연등천 기수지역, 여수 돌산 갓김치, 금일도 야생초 군락지 흙, 부산 피트모스 시비 경작지 흙에서 호기적으로 분리되었다.

Fig. 1. Extracellular lipolytic enzyme activity results of representative strains in this study.

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Fig. 2. Phylogenetic analysis of 4 isolates and their closely related type strains. The phylogenetic tree was constructed based on 16S rRNA gene sequence alignments using the Neighbour-Joining method in MEGA 11.0. Bootstrap values are indicated at the branch points. The scale bar indicates a branch length equivalent to 0.01 changes per nucleotide. Virgibacillus campisalis IDS-20^T and Paenibacillus aceti L14^T served as outgroup.

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선별된 4종의 균주 모두 pH 7.0에서 생육이 가능하였으며, pH 4.0과 9.0에서도 각 2종의 생육이 확인되었으며, 이는 분리 균주들이 넓은 범위의 pH 조건에서 생육이 가능함을 알 수 있었다(Table 1). 또한, B. subtilis 균주의 경우 높은 염농도에서도 생육이 가능한 호염성 균주라는 보고에 따라 분리된 균주가 호염성 미생물로 높은 염 농도에서도 생육이 가능한지를 확인하기 위하여 marine agar 배지에 최종 3‒15%(w/v) NaCl 함유되도록 제작하여 분리 균주들의 생육을 실험한 결과, 모든 분리 균주들은 3-5%(w/v) NaCl 조건에서도 생육이 가능하였고, 3종이 10%(w/v)에서, 1종이 15%(w/v)에서 생육 가능하여 분리된 B. subtilis 균주가 전반적으로 높은 염농도에서 생육이 가능함을 확인하였다(Ji et al., 2020). Marine agar는 구성성분의 대부분이 무기염으로 미생물 대량 배양에 적용하기에는 적합하지 않으므로 분리 균주들의 산업적으로 사용되는 복합배지에서의 생육 가능성을 확인하기 위하여 몇 종류의 복합배지에서 분리 균주들을 배양한 결과, 4 균주 모두 3종류의 배지에서 생육이 가능한 것으로 확인되었다(Table 1). 이 결과는 배지 성분에 따라서 분리 균주의 생육 가능성이 좌우되는 것으로 추후 산업적으로 이용하기 위해선 배지 성분의 최적화에 장점을 갖는 특성으로 판단되었다. 추가적으로 분리된 균주들이 고온균의 특성도 나타내는지 확인한 결과, 4종 모두 50°C에서 생육 가능하였고, 3종이 55°C에서 생육이 가능한 것을 확인하여 분리된 4종은 고온성 균주로 판단되었다(Table 1). 여수 연등천 기수지역, 여수 돌산 갓김치, 금일도 야생초 군락지 흙, 부산 피트모스 시비 경작지 흙에서 호기적으로 분리된 4균주의 16S rDNA 염기서열을 바탕으로 EzBioCloud 시스템을 활용하여 확인하였다. Table 2에서 나타낸 것처럼 분리된 YS-YR 5A, YS-DK 1C, GIYS-2-2-2, M264는 Bacillus subtilis NCIB3610^T와 가장 유사한 균주로 확인되었으며, 상동성은 100.0, 100.0, 99.0 및 99.9%를 각각 나타내었다.

분리된 균주 4종 모두 lipase 활성을 보유하였고(Fig.1), 그 활성은 균주별로 차이를 나타내었으며 YS-YR 5A가 가장 높은 값을 나타내었다(Table 2). Amylase 활성은 4종의 균주에서 모두 우수하였으며, 2종의 균주는 우수한 protease 활성을 보였다. 최종적으로, YS-YR 5A 균주는 3가지 효소(lipase, amylase, protease) 활성이 모두 우수하였다(Table 2).

따라서 본 연구에서 분리한 균주는 국내 여러 특수환경 시료로부터 분리한 다양한 특성을 갖는 B. subtilis 자원의 다양성 확보 차원에서 큰 의미를 찾을 수 있을 것이며, 산업용 가수분해효소 관련 생물공학 및 세포외 지방분해효소 활성이 우수한 프로바이오틱스 미생물제제로의 사용을 위한 생물소재로 활용이 가능할 것으로 예상된다. 또한 본 연구를 통하여 분리한 모든 균주들은 KRIBB 미생물가치제고사업단에 기탁(YS-YR 5A, NMC4-B256; YS-DK 1C, NMC4-B194; GIYS-2-2-2, NMC6-B297; M264, NMC8-B272)하였다.