박테리오신 생산 Lactococcus lactis CJNU 3001 균주의 Clostridioides difficile 억제능

본 연구에 사용된 박테리오신 생산 유산균주인 L. lactis CJNU 3001 균주는 선행연구에서 김치로부터 분리되었다(Yang and Moon, 2018). L. lactis CJNU 3001 균주는 MRS(de Man, Rogosa and Sharpe; BD, Sparks, MD, USA) broth에서 정치배양하였다. C. difficile KCTC 5009 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures; KCTC)로부터 분양 받아 사용하였으며RCM(Reinforced Clostridial Medium; BD) broth에서 혐기적으로 배양하였다. 혐기배양장치는 Don Whitley Scientific 사(Bingley, UK)의DG250 모델을 사용하였다.

C. difficile KCTC 5009 균주에 대한 L. lactis CJNU 3001 균주의 항균 활성을 확인하기 위하여 한천확산법(Daeschel, 1992)을 이용하였다. 즉, RCM 고체배지 위에 L. lactis CJNU 3001 균주 배양액 2 μL를 점적하여 혐기적인 조건에서 37°C, 12시간 배양 후 그 위에 C. difficile KCTC 5009 균주 배양액이 2% 접종된 RCM soft agar(1.2% agar, w/v) 6 mL를 붓고 혐기적인 조건에서37℃, 24시간 배양한 후 콜로니 주변에 생육저해환이 형성되었는지를 확인하였다.

L. lactis CJNU 3001 균주가 생산하는 박테리오신의 부분정제를 위해서 아세톤 추출법(Chung et al., 2011)을 일부 수정하여 사용하였다. 즉, 균주 배양액을 원심분리(4°C, 7,155 g, 10분)한 후 상등액을 회수하여 NaOH로 pH를 7.0으로 조정 후 제균 여과하였다(0.22 μm membrane filter; Agela Technologies, Tianjin, China). 이를 동결건조한 후 최소량의 멸균수에 현탁하고 아세톤(물 : 아세톤=1:3)을 첨가하였다. 이후 –20°C에서 3시간 동안 정치하면서 30분 간격으로 섞어 주었다. 이를 원심분리(4°C, 9,000 g, 20분)한 후 불용성의 중간층을 회수하여 멸균수에 현탁해 부분정제 박테리오신 용액으로 사용하였다.

부분 정제된 박테리오신의 활성 측정을 위하여 상기의 한천확산법을 이용하였고 시료를 단계적으로 2배씩 희석한 후 C. difficile KCTC 5009 균주가 분주된 고체배지 위에 2 μL씩을 점적하였으며 혐기배양장치에서 하룻밤 배양을 진행하였다. 박테리오신 활성은 임의 단위(AU/mL)를 사용하여 나타냈으며 이는 생육저해환을 보이는 최대 희석배수의 역을 취하고 1 mL에 대한 환산계수(500)를 곱한 값이다(Daeschel, 1992).

부분 정제된 박테리오신의 C. difficile KCTC 5009 균주에 대한 항균 작용 양상을 확인하기 위하여 1/10 RCM 액체배지(정상적인 배지 성분의 10%만 첨가)에 하룻밤 배양한 C. difficile KCTC 5009 균주 1%를 접종하고 각각 최종농도 2.5, 5.0 AU/mL의 박테리오신 용액을 첨가하였다. 이를 혐기배양장치에서 배양하면서 경시적으로(0, 3, 6시간) 생균수를 측정하였다.

L. lactis CJNU 3001 균주와 C. difficile KCTC 5009 균주의 경쟁을 분석하기 위하여 RCM broth와 CMM(colon model medium) broth를 사용하였다. CMM broth는 Day-Walsh 등의 방법을 일부 변경하여 제조하였다(Day-Walsh et al., 2021). 즉, 증류수 1 L 기준으로 peptone water 2 g, yeast extract 2 g, NaCl 0.1 g, K₂HPO₄ 0.04 g, KH₂PO₄ 0.04 g, MgSO₄·7H₂O 0.01 g, CaCl₂·2H₂O0.01 g, NaHCO₃2 g, Tween 80 2 mL, Vitamin K₁ 10 μL, cysteine·HCl 0.5 g, Bile salts 0.5 g, Hemin 0.02 g, glucose 10 g이 포함되었다. 각각의 균주 배양액을 멸균수로 2회 세척한 후 RCM broth와 CMM broth 5 mL에 1%씩 동시 접종하였다. 이후 37℃에서 혐기배양하면서 경시적으로(0, 3, 6, 9, 12, 18, 24시간) 생균수를 측정하였다. L. lactis CJNU 3001 균주선택배지로는 MRS 고체배지를 사용하였고 C. difficile KCTC 5009 균주의 선택배지로는 RCM 고체배지에 항생제D-Cycloserine(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 250 μg/mL, Cefoxitin sodium salt(Sigma-Aldrich) 8 μg/mL를 첨가하여 사용하였다.

L. lactis CJNU 3001 균주의 C. difficile KCTC 5009 균주에 대한 항균활성을 한천확산법으로 확인한 결과, L. lactis CJNU 3001 균주 콜로니 주변에서 깨끗한 생육저해환이 나타나 L. lactis CJNU 3001 균주가 생산하는 박테리오신에 의한 영향인 것으로 추정되었다(Fig. 1A). L. lactis CJNU 3001 균주는 박테리오신 외에도 젖산을 생성하기 때문에 산에 의한 저해도 배제할 수는 없지만 일반적으로 산에 의한 저해는 경계 부분이 흐릿한 특성을 나타낸다(Han and Moon, 2020). 또한 부분 정제된 박테리오신을 점적한 경우에도 생육저해환이 뚜렷하게 나타나 C. difficile KCTC 5009 균주는 L. lactis CJNU 3001 균주가 생산하는 박테리오신에 민감한 것으로 확인되었다(Fig. 1B).

Fig. 1. Antimicrobial activity of Lactococcus lactis CJNU 3001 against Clostridioides difficile KCTC 5009. A: bacterial culture; B: partially purified bacteriocin.

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L. lactis CJNU 3001 균주로부터 생산되는 박테리오신을 부분 정제하기 위해서 아세톤 추출법을 이용하였으며 추출 및 활성 분획한 결과 중간층에서 박테리오신 활성이 확인되었다. 또한 박테리오신 부분 정제액의 활성을 측정한 결과 8,000 AU/mL로 나타났다. 이를 이용하여 L. lactis CJNU 3001 균주가 생산하는 박테리오신의 C. difficile KCTC 5009 균주에 대한 항균작용 양상을 확인한 결과 살균기작(bacteriocidal action mode)을 나타내었다. 즉, 박테리오신 무첨가구의 경우 경시적으로(0, 3, 6시간) C. difficile KCTC 5009 균주의 균수는 각각 6.22, 6.82 및7.20 log CFU/mL로 증가한 반면, 박테리오신 2.5 AU/mL 첨가구의 경우 각각 6.21, 5.54 및 5.69 log CFU/mL를 나타내었고, 박테리오신 5.0 AU/mL 첨가구의 경우 각각 6.21, 4.56 및 4.09 log CFU/mL를 나타내어 농도의존적 생균수 감소가 확인되었다(Fig. 2). 예비실험의 결과 10 AU/mL 이상이 사용되었을 때 시작 시점부터 생균이 검출되지 않았다(data not shown). 이는 L. lactis CJNU 3001 균주가 생산하는 박테리오신이 C. difficile KCTC 5009 균주에 대하여 우수한 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있다.

Fig. 2. Antimicrobial action mode of partially purified bacteriocin from Lactococcus lactis CJNU 3001 against Clostridioides difficile KCTC 5009. ^***p<0.001 vs. control.

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RCM 액체배지에서 두 균주를 경쟁시킨 결과, L. lactis CJNU 3001 균주의 경우 0-6시간까지 빠르게 증식(4.91 → 8.65 log CFU/mL)을 하고 이후 유지되는 양상을 보였다. 반면, C. difficile KCTC 5009 균주의 경우 0-6시간까지 완만한 증식속도(6.02 → 8.00 log CFU/mL)를 보이다가 9시간(7.94 log CFU/mL)까지 생균수가 유지된 후 이후 급속도로 감소하는 양상을 보였으며 18시간 이후에는 생균수 확인이 불가하였다(Fig. 3). 이는 L. lactis CJNU 3001 균주의 증식과정에서 생산된 박테리오신 및 유기산 등이 복합적으로 영향을 미친 것으로 추론되었다.

Fig. 3. Viable cell counts of Lactococcus lactis CJNU 3001 and Clostridioides difficile KCTC 5009 in a co-culture (RCM broth).

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CMM 액체배지에서도 비슷한 양상이 확인되었다. L. lactis CJNU 3001 균주의 경우 0-9시간까지 빠르게 증식(5.46 → 7.74 log CFU/mL)을 하고 이후 생균수가 유지되는 양상을 보였다. 반면, C. difficile KCTC 5009 균주의 경우 0-6시간까지 급격한 증식속도(4.56 → 7.35 log CFU/mL)를 보이다가 9시간(7.55 log CFU/mL)까지 생균수가 유지된 후 급속도로 감소하는 양상을 보였으며 18시간 이후에는 생균수 확인이 불가하였다(Fig. 4). 이는RCM 액체배지와 마찬가지로 CMM 액체배지에서도 L. lactis CJNU 3001 균주의 증식과정에서 생산된 박테리오신 및 유기산 등이 복합적으로 영향을 미친 것으로 추론되었다.

Fig. 4. Viable cell counts of Lactococcus lactis CJNU 3001 and Clostridioides difficile KCTC 5009 in a co-culture (CMM broth).

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CDI 치료에 사용되는 메트로니다졸, 반코마이신 등은 역설적으로 정상적인 장내 미생물 군집을 파괴하기 때문에 CDI 악화 및 재발에 기여한다(Culligan and Sleator, 2016). 따라서 비항생제 대체 치료법 개발이 시급한 실정이다. 마이크로바이옴 기반의 FMT가 현재 광범위하게 시술되고 있고 프로바이오틱스 또한 CDI 치료를 위한 항생제 대체재로서 많은 연구가 수행되고 있다. 특히, 프로바이오틱스는 균종 혹은 균주에 따라 효과에 차이가 있고 단독으로 사용하기 보다는 항생제 보조제로 사용되었을 때 그 효과가 우수한 것으로 확인되었다(Evans and Johnson, 2015; Maziade et al., 2015). 박테리오신은 다양한 박테리아가 생산하는 항균성 펩타이드로 항생제 내성 병원성 세균 제어를 위한 항생제 대체재로서 활발한 연구가 진행되고 있다(Culligan and Sleator, 2016). 특히, 인체에 안전한 프로바이오틱스 균주가 생산하는 박테리오신에 대한 관심이 증대되고 있고 C. difficile 제어를 위한 연구도 활발하다. C. difficile 제어를 위한 대표적인 박테리오신은 나이신(nisin)이다. C. difficile을 인위적으로 접종한(10⁶ CFU/mL)분변시료에 나이신을 농도별로 처리한 결과 50-500 μM 농도에서 C. difficile의 생균이 관찰되지 않았다(O'Reilly et al., 2022). 이는 나이신을 이용하여 장내 감염된 C. difficile을 효과적으로 제어할 수 있음을 시사한다. 또한 기존의 항생제인 반코마이신 및 메트로니다졸과의 비교에서도 나이신은 C. diffcile 생육 저해를 위한 최소저해농도(MIC, minimum inhibitory concentration, μg/mL)에서 가장 낮은 값을 보여 두 항생제에 비해 저해효과가 우수하였다(Bartoloni et al., 2004). 본 연구에 사용한 L. lactis CJNU 3001 균주가 생산하는 박테리오신도 나이신으로 추정되며 상기의 결과들은 CDI 치료에 L. lactis CJNU 3001 균주가 사용될 수 있음을 시사한다. 다만, 실제 장내 환경에서 L. lactis CJNU 3001 균주가 증식하여 C. difficile 균주의 생육 억제를 위한 충분한 양의 박테리오신을 생산할지에 대한 의문점이 있다. 이러한 in vitro 실험의 한계점을 극복하기 위하여 향후 in vivo 실험을 통한 효과 검증이 이루어져야 한다.