김치 유래 유산균 포스트바이오틱스 분획물의 대식세포 활성화

본 연구에서 이용된 김치 유래 유산균은 ㈜코시스바이오(Jincheon, Korea)에서 Kim 등(2022)이 시판 김치로부터 Lactobacillus sakei 및 Leuconostoc mesenteroides를 분리 및 동정하였으며, 이들을 MRS broth에 1 ×10⁷CFU/mL로 조정하여 35°C에서 24시간 공동배양한 후 121°C에서 15분간 멸균하고 원심분리(8000 rpm, 4°C, 20 min, 2236R, LABOGENE, Korea)하여 침전물과 상등액으로 분리하였다. 다음으로 분리한 상등액은 여과(Advantec, Tokyo, Japan), 농축 및 동결건조하여 김치 유산균 유래 포스트바이오틱스(lactic acid bacteria postbiotics; LABP)로 제조했다. 또한, LABP는 40 g을 증류수 150 mL에 용해한 후 95% 주정 5배(w/v)를 첨가하여 충분히 교반하고 원심분리(8,000 rpm, 4°C, 20 min)로 침전물과 상등액을 분리한 후 침전물은 투석(MWCO 12-14 kDa, Spectra/Por^TM, SpectrumLab. Inc., RanchoDominguez, CA, USA), 농축 및 동결건조하여 김치 유래 유산균 포스트바이오틱스의 조다당 획분(crude polysaccharide; LABP-CP)으로, 상등액은 농축 및 동결건조하여 김치 유래 유산균 포스트바이오틱스의 저분자 획분(low molecule; LABP-L)으로 각각 분획하였다(Fig. 1a).

Fig. 1. Fractionation scheme of postbiotics (LABP) by lactic acid bacteria (a). Molecular weight distribution of postbiotics fractions (LABP-L and -CP) by lactic acid bacteria (b).

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본 실험에 사용된 RAW 264.7 세포주는 한국세포주은행(Koean Cell Line Bank, KCLB, Seoul, Korea)에서 입수하였으며 배양에 이용된 배지는 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM; Hyclone, San Angelo, TX, USA)에 10% fatal bovine serum(FBS; Gibco, Waltham, MA, USA)과 1% penicillin/ streptomycin(GenDEPOT, Katy, TX, USA)을 첨가하여 37°C 및 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 대식세포 자극활성을 평가하기 위해 RAW 264.7 세포주를 2.0×10⁶cells/mL로 96 well plate에 각 180 µL씩 분주하여 3시간 배양한 후 일정한 농도로 희석한 시료를 각각 20 µL씩 처리하여 24시간 동안 배양하였다. RAW 264.7 세포주로부터 생성된 산화질소(nitric oxide; NO)의 함량은 Griess assay(Tursun 등, 2016)를 이용하여 sodium nitrate을 통해 표준곡선을 작성한 뒤 함량을 µM로 나타냈다. 대식세포 자극 인자인 tumor necrosis factor(TNF)-α 및 interleukin(IL)-6는 각각 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA) 및 BD Bioscience(San Diego, CA, USA)에서 구입한 enzyme- linkage immunosorbent assay(ELISA) kit로 분석하였고, 각 제조사에서 제공된 recombinant protein을 활용하여 표준곡선을 작성한 후 함량을 ng/mL로 나타냈다.

RAW 264.7 세포주를 48 well plate에 2.5×10⁵cells/mL로 각각 250 µL씩 분주하여 3시간 동안 배양한 뒤 각 시료를 250 µL씩 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 PBS에 용해된 0.0375% neutral red(Duksan chemical; Ansan, Korea) 용액을 처리하여 암실에서 30분간 반응시켰다. 이후, lysis buffer를 처리하여 30분간 반응시킨 후 540 nm의 흡광도에서 측정하였으며, 식세포 활성은 시료 무처리군(negative control; NC)에 대한 백분율로 표기하였다.

분자량 분포는 high performance size exclusion chromatography (HPSEC)로 평가하였다. 적절한 농도로 희석한 시료를PVDF membrane filter로 여과하고 Table 1과 같은 조건으로 분석을 진행하였다. 표준물질은 galactose (Gal; Sigma Aldrich) 및 다양한 분자량의 pullulan (Shodex, Tokyo, Japan)을 이용하였고, retention time (RT)을 통해 표준곡선을 작성한 후 회귀시료 간의 RT을 비교하여 kDa으로 계산하였다.

중성당, 산성당 및 단백질 함량은 각각 glucose(Glc; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 표준물질로 이용하여 phenol- sulfuric acid법(DuBois 등, 1956), glucuronic acid (Glc A; Sigma Aldrich)를 이용하여 m-hydroxybiphenyl 법(Blumenkrantz와 Asboe-Hansen, 1973) 및 bovine serum albumin (BSA)를 이용하여 Bradford(1976)의 방법으로 분석하였으며, w/w%로 나타냈다. 구성당 분석은 Honda 등(1989) 및 Shin 등(2021)의 방법을 참고하여 시료에 2 M trifluoroacetic acid(TFA; Sigma Aldrich)를 처리하여 aldose 단위로 분해하였다. 이후 0.3 M NaOH와 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazoline (PMP; Sigma Aldrich)을 첨가하여 단당류와 PMP를 결합시킨 유도체로 전환시키고 0.3 M HCl을 가하여 중화하였다. 이후, 증류수 및 chloroform(2상 용매계)으로 분리 및 추출한 후 물 층만 분리하여 PVDF membrane filter(0.45 µm, Jaema Trade Inc., Gwangwon, Korea)로 여과하고 HPLC로 분석을 진행하였다. HPLC 분석조건은 Table 1에 나타냈으며, 분석 결과는 peak area와 response factor를 이용하여 mole %로 계산하였다.

모든 시험은 3번 반복하여 분석하였고 결과는 평균±표준편차(standard deviation; SD)로 나타냈다. RAW 264.7의 대식세포 자극 활성 및 식세포 활성의 분석결과는 SPSS V26(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용한 Student’s t-test로 계산하여 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 유의성을 검증하였다. 또한, 구성분 분석의 경우, 성분간 유의성 평가를 위해 분산분석(analysis of variance; ANOVA)을 실시하여 각 측정값 간의 유의성을 Duncan's multiple range test로 p<0.05 수준에서 검증하였다.

대식세포는 선천면역을 대표하는 면역 세포로 외부 병원체에 대해 즉각적인 방어를 제공하고 백혈구 침투를 조정함으로써 항상성과 방어에 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Martinez 등, 2008). 또한, 대식세포는 세포간 통신을 중개하여 면역 반응을 조절하는 단백질인 사이토카인의 생성을 매개하는 것으로 알려져 있다(Arango Duque 와 Descoteaux, 2014). 따라서, 본 연구에서는 김치 유래 유산균을 이용하여 조제한 포스트바이오틱스(LABP)의 처리에 따른 대식세포 활성화 인자인 NO, TNF-α 및 IL-6 생성능을 평가하였다. 대식세포에서 사이토카인의 분비를 촉진해 면역 반응을 유도한다고 알려진 NO의 생성능을 평가한 결과(Fig. 2a), 양성 대조군으로 활용된 LPS 처리군은 1 µg/mL의 농도에서NC 대조군(5.5 µM) 대비 63.1 µM(11.6배 증가)의 생성능을 확인할 수 있었으며, LABP는 10~1000 µg/mL의 농도에서 8.7~28.6 µM(1.6~5.2배 증가)의 농도-의존적인 NO 생성량을 보였다. 또한, 암세포의 직접적인 세포 용해를 유도해 항암작용을 나타내는 TNF-α의 생성능을 확인한 결과(Fig. 2b), 10~1,000 µg/mL의 농도 범위에서 NC 대조군(1.5 ng/mL)에 비하여 1.7~4.4 ng/mL (1.2~3.0배 증가)의 농도-의존적인 생성능을 나타내는 것으로 확인되었다. 다음으로, 면역 세포인 B 세포 분화를 활성화하는 인자인 IL-6의 생성능을 확인한 결과(Fig. 2c), 1000 µg/mL의 농도에서만 NC 대조군(0.2 ng/mL)과 비교하여 0.3 ng/mL(1.4배 증가)로 유의적인 생성능을 보였다. Hur 등(2004)의 연구에서 김치에서 분리된 유산균이 대식세포를 자극해 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 생성을 증가시켜 세포의 면역력 강화에 중요한 역할을 한다고 보고하였는데, 본 연구에서 이를 열처리하여 조제한 LABP 또한 유사한 결과를 나타내어 포스트바이오틱스 또한 면역 기능성 소재로의 활용 가능성을 확인할 수 있었다. 따라서, 면역 증진 관련 기능성 소재로 김치 유래 유산균 포스트바이오틱스의 활용 가능성을 확인할 수 있었으며, 다음으로는 주정침전으로 분획된 고분자 및 저분자 획분의 활성 유도 획분 분리 및 활성 증진 여부를 확인하였다.

Fig. 2. Macrophage stimulating activity of lactic acid bacteria postbiotics (LABP). RAW 264.7 cells were treated with LABP for 24 h and the production of nitric oxide (a), TNF-α (b), and IL-6 (c) was evaluated. The results are presented as the mean ± SD of three independent tests. Asterisks in the bar indicate significant differences between the negative controls (NC) and each group by the Student's t-test. ^*p<0.05, **p<0.01, ^***p<0.001. NC; negative control, LPS; lipopolysaccharide (1 μg/mL), LABP; lactic acid bacteria postbiotics.

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주정침전을 이용한 조다당 획분의 분획은 일반적으로 다당 또는 단백 다당 등의 고분자 물질 분리에 효과적이며, 이러한 방법으로 분획된 고분자 물질이 대식세포로부터 활성화 관련 다양한 사이토카인의 분비 촉진을 유도하여 생체 면역반응에 기여하였다고 보고하였다(Shin 등, 2021). 따라서, 본 연구에서는 LABP를 주정 침전하여 LABP 유래 저분자 획분(LABP-L) 및 고분자 조다당 획분(LABP-CP)으로 분획한 후 대식세포 자극 활성을 재평가하였다. 먼저, NO의 생성능을 확인한 결과(Fig. 3a), LABP는 NC 대조군(3.4 µM) 대비 1~50 µg/mL의 농도에서 4.1~21.7 µM(1.2~6.3배 증가)의 농도-의존적인 NO 생성능을 나타냈으나, LABP-L의 경우 50 µg/mL의 농도에서만 4.6 µM(1.3배 증가)의 NO 생성능을 보였다. 반면, LABP-CP는 1~50 µg/mL의 농도에서 21.9~64.2 µM (6.4~18.7배 증가)의 NO 생성능을 나타내어 통계적으로 가장 우수한 것으로 확인되었다. 이러한 경향은 TNF-α 및 IL-6 생성능에서 유사하게 나타났으며, LABP-CP는 각각 1~50 µg/mL의 농도 범위에서 3.7~4.6 ng/mL(21.0~25.7배 증가)의 TNF-α 생성능과 1~50 µg/mL의 농도 범위에서 0.1~16.9 ng/mL(0.7~537.1배 증가)의 통계적으로 가장 우수한 IL-6 생성능을 나타냈다. Kim 등(2022)의 연구에서 김치 유산균 발효 생약복합물 조다당 획분의 대식세포 자극 활성이 열수 추출물에 비해 우수한 활성을 나타내었는데, 본 연구에서도 이와 유사한 바, 주정침전을 통한 고분자 조다당 획분의 분획이 대식세포 활성촉진에 밀접한 관련이 있는 것으로 확인되었다.

Fig. 3. Macrophage stimulating activity of lactic acid bacteria postbiotics (LABP) and their subfractions (LABP-L and -CP). RAW 264.7 cells were treated with LABP and their subfraction for 24 h and the production of nitric oxide (a), TNF-α (b), and IL-6 (c) was evaluated. The results are presented as the mean ± SD of three independent tests. Asterisks in the bar indicate significant differences between the negative controls (NC) and each group by the Student's t-test. Crosshatch patterns revealed significant differences between samples within the same concentration. *, # p<0.05, **, ## p<0.01, ***, ### p<0.001. NC; negative control, LPS; lipopolysaccharide (1 μg/mL), LABP; lactic acid bacteria postbiotics, LABP-L; low molecule isolated from LABP, LABP-CP; crude polysaccharide isolated from LABP.

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식세포 작용은 외부로부터 침입한 미생물 혹은 항원이 체내로 침입하게 되면 세포는 항상성을 유지하기 위해 원형질막을 이용하여 입자를 삼켜 내부 입자를 제거하는 과정을 의미한다. 대식세포의 식세포 작용은 특정 병원체 및 손상된 세포의 제거와 밀접한 관련을 맺고 있어(Lee 등, 2018), LABP-CP의 처리에 따른 대식세포의 식세포 활성을 분석하였다. Fig. 4에서 나타냈듯이, 양성대조군으로 이용된 LPS는 NC 대조군 대비 1 µg/mL 농도에서 151.1%의 식세포 활성을 유도한 반면, LABP-CP는 1~50 µg/mL 농도범위에서 239.9~273.7%의 우수한 식세포 활성을 나타냈다. Choi 등(1997)의 연구에서 김치 추출물과 L. plantarum 배양액이 대식세포의 탐식 기능을 상승시킨다고 보고하였는데, 본 연구의 결과를 통해 김치로부터 분리된 프로바이오틱스뿐만 아니라, 포스트바이오틱스 또한 식세포 작용을 활성화시킬 수 있음을 확인하였다. 결론적으로, 김치 유래 유산균 포스트바이오틱스 조다당 획분(LABP-CP)은 우수한 면역 자극 활성을 나타냄으로써 기능성 소재로서 산업적 활용 가능성을 제시하였으나, 향후 대식세포 활성화에 기여하는 기전에 대한 연구는 추가적으로 필요할 것으로 보인다.

Fig. 4. Phagocytic activity of crude polysaccharide isolated from LABP (LABP-CP). RAW 264.7 cells were treated with LABP-CP for 24 h and the phagocytic activity was evaluated using a neutral red reagent. The results are presented as the mean ± SD of three independent tests. Asterisks in the bar indicate significant differences between the negative controls (NC) and each group by the Student's t-test. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. NC; negative control, LPS; lipopolysaccharide (1 μg/mL), LABP-CP; crude polysaccharide isolated from LABP.

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HPSEC를 이용하여 LABP, LABP-L 및 LABP-CP의 분자량 분포를 분석한 결과는 Fig. 1b와 같다. LABP는 0.2 kDa의 저분자 물질과 121.2 kDa의 고분자물질이 소량 혼재되어 있는 것으로 확인되었으며 LABP-L는 0.2 kDa인 저분자 물질만이 존재하는 것으로 확인되었다. 반면, LABP-CP는 103.5~126.7 kDa의 물질이 혼재되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 주정침전을 통해 저분자(LABP-L) 및 고분자 물질 획분(LABP-CP)이 효과적으로 분획되었음을 보여주는 것으로, 특히 조다당의 고분자 획분이 대식세포 활성화 및 식세포 작용의 활성화에 기여하고 있음을 확인할 수 있으므로, 이후 대식세포 활성화 포스트바이오틱스 분획물의 화학적 특성을 분석하고자 구성분 및 구성당 분석을 진행하였다.

LABP, LABP-L 및 LABP-CP의 구성분 및 구성당 분석 결과는Table 2에 나타냈다. LABP 및 LABP-L은 유사한 구성분 분포를 보여, 각각 중성당(67.0 및 66.8%), 산성당(20.7 및 26.5%) 및 단백질(12.4 및 6.6%)의 함량에서 유의적인 차이를 보이지 않았다. 그러나 활성 분획물인 LABP-CP의 경우 중성당(64.7%)은 유사하였으나, 산성당은 감소(6.6%)하고 단백질은 28.7%로 중가한 분포를 확인할 수 있었다. 이와 같은 단백질 함량 증가의 가장 주요한 원인은 유산균 세포벽 내 펩티도글리칸층으로부터 유리된 아미노산 또는 단백질이 주정침전을 통해 나타나는 것으로 보이나, 이러한 성분변화가 대식세포 활성화에 기여하는지의 여부는 향후 검토가 필요한 것으로 보인다. 한편, 구성당 분포를 위한 HPLC 크로마토그램은 Fig. 5에 나타냈으며, LABP 및 LABP-L은 주로 glucose(43.4 및 45.4%) 및 galactose(37.2 및 47.3%)를 주요 구성당으로 가졌으며, LABP-CP의 경우, 주요 구성당으로 mannose(59.1%), glucose(23.0%) 및 galactose(14.0%)의 분포를 보였다(Table 2). Park 등(2022) 및 Kook 등(2019)의 연구에 따르면, 유산균(Lactobacilluss spp. 및 Leuconostoc spp.)이 생산하는 대사산물은 mannose, glucose 및 galactose로 구성되어 있다고 보고되고 있으며, 본 연구 결과를 토대로 대식세포 활성화 및 식세포 활성에 기여하는 LABP-CP는 mannan, glucomannan 및 galactomannan 등의 다당류이거나 이들과 단백질이 결합된 단백다당일 가능성을 나타내었다. 추후 ion-exchange 및 size-exclusion chromatography를 통한 분리 및 정제를 통해 LABP-CP의 대식세포 활성화에 관여하는 활성 본체를 분리하여 다당류 구성당의 결합양식 분석과 함께 단백 다당일 경우 아미노산 분석 및 단백질과 다당류 분리에 따른 활성에 미치는 영향 등을 분석하여 활성과 화학적 구조의 상관관계를 확인하고자 한다.

Fig. 5. HPLC chromatogram of crude polysaccharide isolated from LABP for determining sugar composition.

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